比色法
1.原理
維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用，產(chǎn)生藍色物質，其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該藍色物質雖不穩(wěn)定，但在一定時間內(nèi)可用分光光度計于620nm波長處測定其吸光度。
2.儀器
實驗室常用設備 分光光度計 回流冷凝裝置
3.試劑
本實驗所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水
（1） 無水硫酸鈉 Na2SO4
�。�2） 乙酸酐
（3） 乙醚 不含有過氧化物
�。�4） 無水乙醇 不含有醛類物質
（5） 三氯甲烷 應不含分解物，否則會破壞維生素A
檢查方法：三氯甲烷不穩(wěn)定，放置后易受空氣中氧的作用生成氯化氫和光氣。檢查時可取少量三氯甲烷置試管中加水振搖，使氯化氫溶到水層。加入幾滴硝酸銀溶液，如有白色沉淀即說明三氯甲烷中有分解產(chǎn)物。
（6） 25%三氯化銻-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化銻溶液，儲于棕色瓶中（注意避免吸收水分）
�。�7） 50%氫氧化鉀溶液（KOH） W/V
�。�8） 維生素A標準液 視黃醇（純度85% Sigma）用脫醛乙醇溶解維生素A標準品，使其濃度大約為1ml相當于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度。
（9） 酚酞指示劑 用95%乙醇配制1%溶液
4. 操作步驟
維生素A極易被光破壞，實驗操作應在微弱光線下進行。
4.1樣品處理：根據(jù)樣品性質，可采用皂化法或研磨法。
(1)皂化法：
皂化：根據(jù)樣品中維生素A含量的不同，稱取0.5g～5g樣品于三角瓶中，加入20～40ml無水乙醇及10ml1：1氫氧化鉀，于電熱板上回流30min至皂化完全為止。（皂化法適用于維生素A含量不高的樣品，可減少脂溶性物質的干擾，但全部實驗過程費時，且易導致維生素A 損失）
提取：將皂化瓶內(nèi)混合物移至分液漏斗中，以30ml水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脫脂棉漏斗濾入分液漏斗內(nèi)。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣，靜置分層后，水層放入第二個分液漏斗內(nèi)。皂化瓶再用約30ml乙醚分二次沖洗，洗液傾入第二個分液漏斗中。振搖后，靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個分液漏斗合并。重復至水液中無維生素A為止。
洗滌：用約30ml水加入第一個分液漏斗中，輕輕振搖，靜置片刻后，放去水層。加15 ～20ml 0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中，輕輕振搖后，棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。繼續(xù)用水洗滌，每次用水約30ml，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止（大約洗滌3次）。醚層液靜置10～20min，小心放出析出的水。
濃縮：將醚層液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25ml乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶內(nèi)。置水浴上蒸餾，回收乙醚。待瓶中剩約5ml乙醚時取下，用減壓抽氣法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。
(2)研磨法：
研磨：精確稱2～5g樣品，放入盛有3～5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收，并均質化。（研磨法適用于每克樣品維生素A含量大于5～10μg樣品的測定，如肝樣品的分析。步驟簡單，省時，結果準確）
提取：小心地將全部均質化樣品移入帶蓋的三角瓶內(nèi)，準確加入50～100ml乙醚。緊壓蓋子，用力振搖2min，使樣品中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大約需1～2h），或離心澄清（因乙醚易揮發(fā)，氣溫高時應在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應事先置于冷水浴中）。
濃縮：取澄清提取乙醚液2～5ml，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽氣蒸干。立即加入1ml三氯甲烷溶解殘渣。
4.2標準曲線的制備:準確取一定量的維生素A標準液于4～5個容量瓶中，以三氯甲烷配制標準系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1ml三氯甲烷和標準系列使用液1ml，各管加入乙酸酐1滴，制成標準比色列。于620nm波長處，以三氯甲烷調節(jié)吸光度至零點，將其標準比色列按順序移入光路前，迅速加入9ml三氯化銻-三氯甲烷溶液。于6秒內(nèi)測定吸光度，將吸光度為縱坐標，以維生素A含量為橫坐標繪制標準曲線圖。
4.3樣品測定:于一比色管中加入10ml三氯甲烷，加入一滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入1ml三氯甲烷，其余比色管中分別加入1ml樣品溶液及1滴乙酸酐。其余步驟同標準曲線的制備。
6.計算
X = C/m×V×100/1000；
式中
X： 樣品中含維生素A的量，mg/100g（如按國際單位，每1國際
單位= 0.3μg維生素A）；
C： 由標準曲線上查得樣品中含維生素A的含量，μg/ml；
m： 樣品質量，g；
V： 提取后加三氯甲烷定量之體積，ml；
100： 以每百克樣品計。
1.原理
維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用，產(chǎn)生藍色物質，其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比。該藍色物質雖不穩(wěn)定，但在一定時間內(nèi)可用分光光度計于620nm波長處測定其吸光度。
2.儀器
實驗室常用設備 分光光度計 回流冷凝裝置
3.試劑
本實驗所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水
（1） 無水硫酸鈉 Na2SO4
�。�2） 乙酸酐
（3） 乙醚 不含有過氧化物
�。�4） 無水乙醇 不含有醛類物質
（5） 三氯甲烷 應不含分解物，否則會破壞維生素A
檢查方法：三氯甲烷不穩(wěn)定，放置后易受空氣中氧的作用生成氯化氫和光氣。檢查時可取少量三氯甲烷置試管中加水振搖，使氯化氫溶到水層。加入幾滴硝酸銀溶液，如有白色沉淀即說明三氯甲烷中有分解產(chǎn)物。
（6） 25%三氯化銻-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化銻溶液，儲于棕色瓶中（注意避免吸收水分）
�。�7） 50%氫氧化鉀溶液（KOH） W/V
�。�8） 維生素A標準液 視黃醇（純度85% Sigma）用脫醛乙醇溶解維生素A標準品，使其濃度大約為1ml相當于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度。
（9） 酚酞指示劑 用95%乙醇配制1%溶液
4. 操作步驟
維生素A極易被光破壞，實驗操作應在微弱光線下進行。
4.1樣品處理：根據(jù)樣品性質，可采用皂化法或研磨法。
(1)皂化法：
皂化：根據(jù)樣品中維生素A含量的不同，稱取0.5g～5g樣品于三角瓶中，加入20～40ml無水乙醇及10ml1：1氫氧化鉀，于電熱板上回流30min至皂化完全為止。（皂化法適用于維生素A含量不高的樣品，可減少脂溶性物質的干擾，但全部實驗過程費時，且易導致維生素A 損失）
提取：將皂化瓶內(nèi)混合物移至分液漏斗中，以30ml水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脫脂棉漏斗濾入分液漏斗內(nèi)。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振搖并注意放氣，靜置分層后，水層放入第二個分液漏斗內(nèi)。皂化瓶再用約30ml乙醚分二次沖洗，洗液傾入第二個分液漏斗中。振搖后，靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個分液漏斗合并。重復至水液中無維生素A為止。
洗滌：用約30ml水加入第一個分液漏斗中，輕輕振搖，靜置片刻后，放去水層。加15 ～20ml 0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中，輕輕振搖后，棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。繼續(xù)用水洗滌，每次用水約30ml，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止（大約洗滌3次）。醚層液靜置10～20min，小心放出析出的水。
濃縮：將醚層液經(jīng)過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25ml乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次，洗液并入三角瓶內(nèi)。置水浴上蒸餾，回收乙醚。待瓶中剩約5ml乙醚時取下，用減壓抽氣法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內(nèi)。
(2)研磨法：
研磨：精確稱2～5g樣品，放入盛有3～5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收，并均質化。（研磨法適用于每克樣品維生素A含量大于5～10μg樣品的測定，如肝樣品的分析。步驟簡單，省時，結果準確）
提取：小心地將全部均質化樣品移入帶蓋的三角瓶內(nèi)，準確加入50～100ml乙醚。緊壓蓋子，用力振搖2min，使樣品中維生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大約需1～2h），或離心澄清（因乙醚易揮發(fā)，氣溫高時應在冷水浴中操作。裝乙醚的試劑瓶也應事先置于冷水浴中）。
濃縮：取澄清提取乙醚液2～5ml，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽氣蒸干。立即加入1ml三氯甲烷溶解殘渣。
4.2標準曲線的制備:準確取一定量的維生素A標準液于4～5個容量瓶中，以三氯甲烷配制標準系列。再取相同數(shù)量比色管順次取1ml三氯甲烷和標準系列使用液1ml，各管加入乙酸酐1滴，制成標準比色列。于620nm波長處，以三氯甲烷調節(jié)吸光度至零點，將其標準比色列按順序移入光路前，迅速加入9ml三氯化銻-三氯甲烷溶液。于6秒內(nèi)測定吸光度，將吸光度為縱坐標，以維生素A含量為橫坐標繪制標準曲線圖。
4.3樣品測定:于一比色管中加入10ml三氯甲烷，加入一滴乙酸酐為空白液。另一比色管中加入1ml三氯甲烷，其余比色管中分別加入1ml樣品溶液及1滴乙酸酐。其余步驟同標準曲線的制備。
6.計算
X = C/m×V×100/1000；
式中
X： 樣品中含維生素A的量，mg/100g（如按國際單位，每1國際
單位= 0.3μg維生素A）；
C： 由標準曲線上查得樣品中含維生素A的含量，μg/ml；
m： 樣品質量，g；
V： 提取后加三氯甲烷定量之體積，ml；
100： 以每百克樣品計。