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液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下特點：
1.純度。流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細的膜過濾)。溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累，會影響色譜柱的使用壽命。
2.溶解度。樣品的溶解度要適宜如果溶解度，如果溶解度欠佳樣品會在柱頭沉淀，不但影響純化分離，還會縮短柱子的使用壽命。
3.粘度。 要低(應<2cp) 高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
4.樣品易于回收。應選用揮發(fā)性溶劑。
5.流動相。PH 采用反相色譜法分離弱酸(3≤pKa≤7)或弱堿(7≤pKa≤8)樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術稱為反相離子抑制技術。對于弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在;對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。
二、 色譜泵的使用與維護
為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項進行操作：
1.防止任何固體微粒進入泵體，因為塵埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜(0.2µm或0.45µm)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經(jīng)常清洗或更換。
2.泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。
3.輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。
三、色譜柱的使用與維護
在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護十分重要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命，在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。
1.柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。
2.如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
3.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。
4.應逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬�，反之亦然�?nbsp;
5.如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。
6.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。
7.選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8.避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。
9.經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
10.保存色譜柱時應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。
11.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗;另一種可能是大分子進人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
12.在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。
