【實(shí)驗(yàn)原理】

 

聚酰胺薄膜層析是60年代以后發(fā)展起來(lái)的一種新的層析方法，特別適用于氨基酸及其衍生物的分析。具有靈敏度高、分辨率強(qiáng)、操作方便快捷等特點(diǎn)。

聚酰胺是一類(lèi)化學(xué)纖維素原料，即錦綸（尼龍）。由乙二酸和乙二胺聚合而成的，稱(chēng)錦綸66。

 

由于分子中含有大量的酰胺基團(tuán)，故稱(chēng)聚酰胺。聚酰胺薄膜是在滌綸片基上涂上一層錦綸制成的。聚酰胺對(duì)許多極性物質(zhì)有吸附作用，這是由于聚酰胺的-C=O和-NH- 能與被分離物質(zhì)的一定基團(tuán)形成H鍵。如酚類(lèi)（黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)）和酸類(lèi)（氨基酸、核苷酸）能以其羥基與酰胺鍵的羰基形成H鍵。在層析過(guò)程中，當(dāng)樣品隨流動(dòng)相通過(guò)聚酰胺薄膜時(shí)，由于聚酰胺與各極性分子產(chǎn)生H鍵吸附能力的強(qiáng)弱不同，從而可將樣品中各成分分離。

物質(zhì)分離后，層析點(diǎn)在圖譜上的位置，即在濾紙上的移動(dòng)速率，用Rf來(lái)表示。

 

在一定條件下，每個(gè)物質(zhì)都有特定的Rf值，因此，用Rf可鑒定不同的物質(zhì)。

無(wú)色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法（紫外照射）或顯色法鑒定。氨基酸層析圖譜常用茚三酮作顯色劑。本實(shí)驗(yàn)利用單向上行層析法鑒定氨基酸。

【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】

(一) 試劑

1. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml)：三種氨基酸是賴(lài)氨酸、脯氨酸、纈氨酸，分別配成上述濃度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每種氨基酸5mg/ml）

3. 展層劑：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）

4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材

聚酰胺薄膜，毛細(xì)管，層析裝置，電吹風(fēng)機(jī)，噴霧器， 塑料手套等。

【實(shí)驗(yàn)方法】

(一) 薄膜的剪裁

取薄膜（7cm×10cm）一張，在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一直線，在此直線上每隔1厘米作一記號(hào)為點(diǎn)樣處（外側(cè)兩點(diǎn)距邊緣2cm）。

(二) 點(diǎn)樣

氨基酸的點(diǎn)樣量以5ul為宜。點(diǎn)樣時(shí)，用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與薄膜垂直方向輕輕碰點(diǎn)樣處，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過(guò)2mm。點(diǎn)樣過(guò)程中，必須在第一點(diǎn)樣品干后再點(diǎn)第二滴。為加快樣品干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，注意溫度不宜過(guò)高，以免損壞氨基酸。

(三) 展層

在層析缸中放一個(gè)小培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中倒入適量展層劑，將點(diǎn)好樣品的薄膜斜立于培養(yǎng)皿中（注意點(diǎn)樣的一端在下），展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線１厘米。當(dāng)溶劑前沿距上邊緣１厘米處時(shí)，取出膜片，立即用筆標(biāo)出溶劑前沿的位置，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。

（四）定性鑒定

用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均勻噴霧。晾干后，用一直尺測(cè)量每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求其比值，即得各種氨基酸的Rf值。

在層析圖譜上，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的位置（Rf值），確定氨基酸混合樣中氨基酸的種

類(lèi)及位置。

【注意事項(xiàng)】

1. 選用合適、潔凈的薄膜。勿用手直接接觸薄膜。

2. 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大（其直徑應(yīng)小于2mm）。吹風(fēng)機(jī)溫度不宜過(guò)高，否則斑點(diǎn)變黃。

3. 根據(jù)一定目的、要求，選擇合適的溶劑系統(tǒng)。