近年來,芯片介電電泳研究已從最初對生化樣品的簡單富集操作,擴展到對納米材料、金屬顆粒等物質的富集、分離和操控等[1~3]諸多方面。將介電電泳技術與流體力[4]、電場力[5]、激光鑷子[6]等模式結合也成為研究的新方向,而芯片介電電泳分析系統(tǒng)中的微電極結構是決定分析效能的關鍵因素之一。因此,設計出分離性能更高、結構更合理的微電極一直是人們關注的重點,目前,介電電泳電極構型已由過去傳統(tǒng)的平面式電極向三維式電極發(fā)展,出現(xiàn)了夾板式電極、籠式電極和絕緣柱式電極等[7,8]多種構型。相比于常規(guī)電泳分析生化樣品時必須對樣品對象進行復雜預處理或前衍生的缺陷,芯片介電電泳技術可依據(jù)樣品本身介電性質,在不進行預處理的情況下直接對樣品進行DEP富集操控,從而最大限度保持了樣品的生理活性;同時介電電泳芯片采用MEMS技術加工制作,整個操作過程都易于調控和實現(xiàn)集成化、自動化;芯片DEP過程中大多采用低壓高頻交流信號源,易于實現(xiàn)與其它分析方法的聯(lián)用。芯片介電電泳由于具有以上特點使其在生化樣品分析方面具有獨特優(yōu)勢。

     介電電泳芯片分析系統(tǒng)通常由樣品進樣和DEP驅動單元、樣品富集和分離單元以及檢測單元3部分構成。樣品富集和分離過程在具有微電極或絕緣體結構的介電電泳芯片上實現(xiàn)。樣品進樣是通過在介電電泳芯片微通道兩端施加DEP直流信號或注射微泵驅使溶液流動來完成的。由交流信號激發(fā)的介電電泳稱為交流式介電電泳(AC-DEP),交流信號連接在芯片微電極上用以激發(fā)分析對象極化,實現(xiàn)DEP富集分離樣品的目的;直流信號激發(fā)的介電電泳稱為直流式介電電泳(DC-DEP),直流信號直接加在芯片微管道兩端,利用微管道內的絕緣體使管道內的電力線發(fā)生扭曲,產生非均勻電場實現(xiàn)樣品的DEP富集操控。

DEP芯片的微電極構型是決定樣品富集位置的重要因素。常規(guī)介電電泳芯片的電極構型包括堡式電極、拋物線式電極、叉指式電極和圓點式陣列電極等。目前,三維式電極結構由于其富集操控手段的靈活性和電極設計和制作形式的多樣性,也是目前研究的熱點。AC-DEP模式是最初人們研究介電電泳現(xiàn)象時采用的DEP信號驅動模式,進入本世紀后,人們開始探索DC-DEP和可實現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的流動式分離模式。

     介電電泳分析中最普遍的檢測手段仍是CCD顯微成像或熒光顯色CCD顯微成像技術,通過顯微鏡觀測分析對象在介電電泳力代寫論文下的富集分離情況獲取分析信息。除了常規(guī)的CCD顯微成像檢測手段,將電化學檢測手段與芯片DEP模式耦合,是現(xiàn)今DEP檢測技術的發(fā)展趨勢[9]。

     利用芯片介電電泳進行生物樣品的富集和分離時,樣品可在DEP作用下根據(jù)自身物理性質的差異富集在DEP芯片的不同位置。單純依靠DEP作為分離富集驅動力時,只能實現(xiàn)微粒的靜態(tài)原位富集和分離,將這種模式稱為靜態(tài)原位富集模式。當介電電泳力與其它分離方法結合時實現(xiàn)的連續(xù)動態(tài)富集分離過程,稱為動態(tài)富集分離模式。

     DEP靜態(tài)原位富集模式是介電電泳研究中最早采用的模式,這時樣品富集位置主要取決于DEP芯片中微電極構型的變化,不同的微電極結構所對應的正負DEP富集位置不同,樣品依據(jù)自身介電性質差異受不同類型DEP作用,富集于芯片的不同位置。

Xu等[10]在帶有堡式電極的介電電泳芯片上觀測到了紅細胞的介電電泳現(xiàn)象。Ramadan等[11]在堡式電極結構上實現(xiàn)了白血球(WBS)、小鼠無性細胞(MN9D)和酵母菌的介電電泳富集,并利用電穿孔技術實現(xiàn)了細胞的電溶解(圖1),其管道內溶液流速與細胞融膜率成反比。Arnold等[12]制作了一種可以捕獲和培育細胞的具有類堡式電極結構的DEP芯片,通過控制交流信號使酵母菌在負介電電泳(nDEP)和重力作用下懸浮在分離通道內,降低交流信號頻率,使酵母菌沉降以實現(xiàn)細胞富集,并在片上進行細菌培養(yǎng),實現(xiàn)了一系列的細菌懸浮、富集和片上培養(yǎng)操作。

     Li等[13]應用平行陣列電極實現(xiàn)了微芯片上死活李斯特菌的原位分離富集,并通過對細菌熒光染色后區(qū)分其活性,再進行熒光顯微成像檢測。Zhou等[14]設計了一種可以產生交流電滲擴增的介電電泳芯片,芯片電極為三維構型,底面采用陣列電極結構,頂面電極為覆蓋整個微管道的面電極,在這種裝置上實現(xiàn)了膠體微粒/酵母菌、紅細胞/酵母菌混合樣品體系的原位富集分離,并對這種情況下樣品所受的重Fig. 1　Image of enrichment and lysis process steps of WBC[11]

     圖2  拋物線式電極結構上溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離[15]Fig. 2  Separation of M.lysodeikticusand E.colion the microchip witha quadrupole electrode[15]力、DEP力和交流電滲力做了理論探討。Pethig[15]在拋物線式電極上實現(xiàn)了酵母菌的正介電電泳(pDEP)和負介電電泳(nDEP)富集,以及溶壁微球菌和大腸桿菌混合樣品的分離,并利用這一裝置研究了樣品的生理特性。圖2為溶壁微球菌和大腸桿菌在該裝置上的分離圖像。Abidin等[16]制作了一種可產生高梯度電場的DEP分離(HGES)系統(tǒng),這種DEP分離裝置由兩個同心圓柱構成,圓柱與交流信號源接通,圓柱中間填充玻璃微珠用以產生高梯度的非均勻電場,以釀酒酵母為樣品討論了這種裝置的捕獲效率,并討論了同心電極尺寸和玻璃微珠直徑對細菌捕獲效率的影響。

     Ho等[17]設計了一種同心星狀電極結構的DEP芯片,一系列的同心圓電極結構擴增了DEP信號,有效增強了系統(tǒng)的DEP富集效率。利用這一裝置富集肝細胞和內皮細胞,并采用熒光染色方式進行后續(xù)檢測,裝置結構圖和實驗圖像如圖3所示。

圖3  同心星狀電極DEP芯片[17]Fig. 3　On-chip heterogeneous-cells patterning demonstration[17]在DEP分離中,樣品除了受DEP力作用外,在電極附近還會受到電滲流作用使樣品發(fā)生擾動,通常情況下,分析體系中的電極和樣品都是μm尺度的,電滲流對DEP作用的負面影響往往可以忽略不計,但當樣品微粒小至nm尺度時,這一影響就不容忽視。為了消除電滲流對納米微粒富集的影響, Luo等[18]制作了一種電極寬度在nm級的DEP芯片,實現(xiàn)了納米級聚苯乙烯微粒和牛血清白蛋白(BSA)的DEP富集。

2·2　芯片介電電泳的分離富集模式單純依靠常規(guī)的電極構型產生DEP力對樣品進行介電富集和分離時,很難實現(xiàn)樣品的連續(xù)分離和快速檢測。因此,設計出結構合理、利于實現(xiàn)連續(xù)測定的電極構型或者將其它分離技術與芯片介電電泳技術結合,實現(xiàn)樣品的連續(xù)富集分離和操控是近年來芯片介電電泳研究的熱點。2·2·1　DEP與流體力偶合分離　程京等[19]采用棋盤式陣列電極(5×5)將DEP力和流體力結合,實現(xiàn)了外周血細胞(Blood細胞)中宮頸癌細胞(HeLa細胞)的連續(xù)富集和分離。實驗采用Tris-硼酸緩沖液,分離條件為6V、30kHz,緩沖液流速控制在200μL/min,此時HeLa細胞受pDEP作用被富集在電極表面,而Blood細胞受nDEP作用富集在電極之間,之后利用流體力將Blood細胞沖入廢液池,而Hela細胞仍富集在電極表面,利用熒光染料對富集在電極表面的HeLa細胞染色后,進行顯微成像檢測。Doh等[20]設計了一種可實現(xiàn)樣品連續(xù)富集分離的微流控DEP芯片(圖4),細胞混合樣品注入具有三電極結構的微管道內,受pDEP作用的樣品偏離管道中心向管道兩邊富集而從出口1流出,受nDEP作用的細胞運動方向不變從出口2流出,由此實現(xiàn)死活酵母菌的連續(xù)流動分離。結果表明,細菌分離效圖4　連續(xù)介電電泳DEP分離過程示意圖[20]

     Fig. 4　Scheme of hydrodynamic dielectrophoresis (DEP)process[20]率與溶液流速成反比。Suehiro等[21]將抗體固定到叉指電極式DEP芯片表面,利用pDEP力將混合樣品富集到芯片表面,利用抗原和抗體的特異性吸附作用,使靶細胞與固定在芯片表面的抗體結合,再利用液流將非靶細胞沖走,實現(xiàn)了兩種特定細胞的流動式介電富集和分離過程。Yang等[22]將該方法用于李斯特菌的介電誘捕免疫富集。Voldman等[23]在傳統(tǒng)叉指電極式DEP芯片的基礎上,在分離通道頂部采用SU-8制作了一系列無序攪拌凹槽,使溶液形成湍流,增加樣品與電極的接觸幾率,利用pDEP作用將樣品富集于電極表面。該設計中攪拌凹槽的引入間接提高DEP富集效率,可以明顯提高聚苯乙烯微珠和B.subtilis孢子的富集效果。

     Li等[24]設計了一種將進樣、餾分和樣品收集三個單元集成在一起的芯片。在進樣區(qū)域,通過液鞘的夾流作用控制樣品寬度,餾分單元部分管道底部布有平行電極(電極寬度和間距均為10μm)用以產生非均勻電場,完成細胞樣品的分離和篩選,最后,經過分離篩選的細胞樣品從兩個出液口排出而被收集。他們對該芯片進樣區(qū)域的微流控過程進行了計算機模擬,并采用酵母菌為模板樣本對裝置的分離效果進行了驗證。Cummings等[25]提出了絕緣式介電電泳(iDEP)的概念。在常規(guī)的十字芯片內刻蝕一系列絕緣體柱,將直流電信號施加在芯片微管道兩端,通過管道內的絕緣體柱擾動電力線以形成非均勻電場。他們對DC-DEP模式的理論分析和實驗研究發(fā)現(xiàn),在此模式下微粒會經歷流動式介電電泳(streaming-DEP)和誘捕式介電電泳(trapping-DEP)2種狀態(tài);不同絕緣體形狀(圓形陣列電極、菱形陣列電極)、絕緣體直徑以及絕緣體間夾角變化對通道內電場強度梯度分布也有影響。他們對活性大腸桿菌(E.coli)和失活的E.coli的混合樣品進行了連續(xù)富集和分離[26];實現(xiàn)了污水[27]中E.coli、革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)的兩兩富集分離;富集了革蘭氏陽性細菌枯草芽孢桿菌(B.subtilis spores)、煙草花葉病病毒(TMV)和E.coli單樣品[8],其中E.coli的富集效率接近100%。他們的研究引起了分析工作者對DC-DEP分析模式的濃厚興趣。Kang等[28]設計了另一種結構的DC-DEP芯片,利用分離通道中絕緣的聚苯乙烯鏈段,使電力線發(fā)生扭曲,產生非均勻電場,聚苯乙烯微球在介電電泳力和流體力的共同作用下依據(jù)微粒尺寸得到分離(如圖5所示)。Barbulovic-Nad等[29]采用油滴作為絕緣體,通過控制油滴的尺寸間接調整DEP力實現(xiàn)了不同尺寸介電微粒的連續(xù)分離。

     圖5　絕緣電極式DEP芯片分離直徑為5·7和15·7mm的聚苯乙烯微粒[28]Fig. 5　Separation of 5·7 and 15·7 mm particles by applied voltages on different electrodes at 500 V voltage level[28]2·2·2　DEP與激光鑷子耦合分離　1998年Morishima等[30]將激光鑷子技術與DEP技術結合,芯片采用拋物線式電極結構,通過nDEP使大腸桿菌富集,同時激光鑷子將單個樣品移動到監(jiān)測點進行后續(xù)分析,實現(xiàn)了細胞樣品的單個檢測和操控。Arai等[31]在這兩種方法耦合的基礎上引入流體力,將單個酵母菌樣品從分析區(qū)域轉移出微通道(圖6)。介電電泳與激光鑷子技術聯(lián)用,不能實現(xiàn)大量樣品的高效快速富集分離操作,但卻可以實現(xiàn)單個樣品的精確操控,這為臨床上獲得純度為100%的生物樣品提供圖6　細胞操控過程示意圖[31]Fig. 6　Transportion trajectory ofthe target cell[31]了可能。

2·2·3　其它耦合模式的分離　Cui等[32]設計了一種行波介電電泳(twDEP)DEP芯片,其具有一系列平行陣列電極,通過在其上施加相差為90°的交流信號可實現(xiàn)樣品twDEP驅動,將樣品進行pDEP富集于twDEP電極的初始位置,再對樣品進行twDEP操控(圖7),實現(xiàn)了乳膠微粒和小鼠心肌細胞的電懸浮和連續(xù)流動操控。

　　Taff等[33]給出一種可以設置細胞富集位置的pDEP細胞篩分陣列的芯片設計,采用同心圓式雙層陣列電極,通過對陣列電極的定位控制,實現(xiàn)了單個人類血癌細胞的誘捕、操控和釋放。Cheung等[34]設計了夾板式和籠式電極結合的介電電泳芯片(圖8),在359kHz~20MHz范圍內,采用阻抗檢測對經過不同處理的紅細胞進行分離和阻抗分析,分析速度達到1000個/min。Yasukawa等[35]提出一種能夠用于免疫分析的介電電泳芯片。該芯片采用三維電極結構,能夠在芯片微管道內形成介電籠,將作為固相載體的聚苯乙烯固定在芯片管道中,實現(xiàn)了流動體系中抗原與抗體的完全反應,此系統(tǒng)能夠在40min內完成對小鼠IgG的免疫分析。