氫氘交換質譜法是一種研究蛋白質空間構象的質譜技術。它在蛋白質結構及動態(tài)變化研究、蛋白質相互作用位點發(fā)現(xiàn)、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應用。隨著氫氘交換質譜技術的不斷發(fā)展，它正在成為結構生物學家及生物藥物研發(fā)的重要手段。

 

氫氘交換質譜（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一種研究蛋白質空間構象的質譜技術。其原理是將蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氫原子將于重水的氘原子發(fā)生交換，而且蛋白質表面與重水密切接觸的氫比位于蛋白質內部的或參與氫鍵形成的氫的交換速率快，進而通過質譜檢測確定蛋白質不同序列片段的氫氘交換速率，從而得出蛋白質空間結構信息[1]。這個過程就像將握著的拳頭浸入水中，然后提出水面并張開手掌。這時，濕潤的手背表明它在“拳頭”的結構中處于外表面，而較為干燥的手心表明它是“拳頭”的內部。除樣品制備外，氫氘交換質譜法的主要過程包括：交換反應、終止反應、將蛋白快速酶切為多肽、液相分離、質譜檢測、數(shù)據解析。其中交換步驟需要在多個反應時長下進行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以繪制交換率曲線，得到準確全面的信息。氫氘交換質譜技術在蛋白質結構及其動態(tài)變化研究[1]、蛋白質相互作用位點發(fā)現(xiàn)[2]、蛋白表位及活性位點鑒定方面有著廣泛的應用[3]。

 

與經典的蛋白質結構研究方法相比，如X射線晶體衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氫氘交換質譜不能夠提供精確的蛋白空間結構，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白質空間結構的表面位置（包括動態(tài)變化中的）、可能的活性位點和蛋白-蛋白相互作用位點等。但是氫氘交換質譜技術有著其他經典方法不具備的優(yōu)點：首先，可以進行蛋白質結構動態(tài)變化的研究是氫氘交換質譜的一個突出優(yōu)點，包括變化中的活性位點及表位；其次，氫氘交換質譜在蛋白復合體構象的研究中也具有獨到的優(yōu)勢；此外，氫氘交換質譜還具有對樣品需求量小、純度要求相對較低、研究對象為溶液環(huán)境下的蛋白質的天然構象而非晶體中構象等優(yōu)勢[1,4,5]。自1991年第一篇研究論文發(fā)表起，氫氘交換質譜技術不斷發(fā)展，已經成為結構生物學及質譜技術中一個非常重要的應用領域[6]。但是氫氘交換質譜實驗的復雜的實現(xiàn)過程在一定程度上影響了其應用的廣泛度。主要的難點有：1、如何避免交換后氘代肽段的回交現(xiàn)象；2、實驗控制的高精確性和重現(xiàn)性要求；3、交換后造成的疊加的質譜峰如何準確分辨；4、簡易高效的分析軟件需求；5、以氨基酸為單位的交換位點辨析。沃特世公司自2005年起，針對以上難點不斷進行攻關，推出了目前唯一商業(yè)化的全自動氫氘交換質譜系統(tǒng)解決方案--nanoACQUITY UPLC? HD-Exchange System(圖1)。在全世界范圍內，這套系統(tǒng)已經幫助科學家在包括Cell、Nature等頂級研究期刊中發(fā)表研究論文[7,8]。除科研需求外，沃特世氫氘交換質譜系統(tǒng)也受到眾多國際領先制藥公司的認可，并用于新藥開發(fā)中蛋白藥物活性位點及表位的研究工作中。

 

氫氘交換實驗中的回交現(xiàn)象將嚴重影響實驗數(shù)據的可信度，甚至導致錯誤結果的產生。要避免回交需要做到兩點：盡量縮短液質分析時間和保證液質分析中的溫度和pH為最低回交反應系數(shù)所要求的環(huán)境。沃特世UPLC?系統(tǒng)采用亞二納米色譜顆粒填料，較HPLC使用的大顆粒填料，UPLC具有無與倫比的分離度。因此UPLC可以做到在不損失色譜分離效果的要求下，極大縮短液相分析時間的要求[9]。對于對溫度和pH控制問題，在多年的工程學改進中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已經實現(xiàn)了對酶切、液相分離等步驟的全程控制[10]。

 

對氫氘交換質譜實驗精確性和重現(xiàn)性的要求是其應用的第二個主要難點。在實驗中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多個時間點的數(shù)據。如果進行人工手動實驗，很難做到對10S-10min等幾個時間點的精確操作。再考慮到重復實驗的需求，人工手動操作會對最終數(shù)據可信度產生影響。而且實驗過程重復繁瑣，將給實驗人員帶來非常大的工作壓力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通過智能機械臂，精確完成交換、終止交換、進樣、酶切等一系列實驗過程，而且始終保證各個步驟所需不同的溫度環(huán)境。這些自動化過程不但保證了實驗數(shù)據的可靠性，提高了實驗效率，也將科學家從繁瑣的重復實驗中解放出來。

 

氫氘交換實驗的質譜數(shù)據中，隨著交換時間的延長，發(fā)生了交換反應的多肽，由于質量變大，其質譜信號將逐漸向高質荷比方向移動。因此，這些質譜峰可能與哪些未發(fā)生交換反應的多肽質譜峰逐漸疊加、相互覆蓋。相互疊加的質譜信號，不但影響對峰歸屬的判斷，更會增加交換率數(shù)據的誤差。因為交換率判斷需要通過對發(fā)生交換的多肽進行定量，毫無疑問因疊加的而混亂的質譜數(shù)據將極大的影響對質譜峰的準確定量。這點對于單純通過質荷比進行分析的質譜儀來說完全無能為力。但是，這個看似不可能完成的任務卻被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。這是因為，不同于其它常見質譜，沃特世的SYNAPT?質譜平臺還具備根據離子大小及形態(tài)進行分離的功能（行波離子淌度分離）。在數(shù)據處理時，除多肽離子的質荷比信息外，還可以通過離子遷移時間（離子淌度維度參數(shù)）將不同離子區(qū)分。因此這種SYNPAT獨有的被命名為HDMSE的質譜分析技術可以將因質荷比相同而重疊的多肽分離開，輕而易舉地解決了質譜信號疊加的問題，得到準確的交換率數(shù)據[11,12]（圖2）。SYNPAT質譜平臺一經推出就奪得了2007年PITTCON金獎，目前已經推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型號，并具備ESI、MALDI等多種離子源。除氫氘交換技術外，SYNAPT質譜系統(tǒng)在蛋白質復合體結構研究中也是獨具特色，已有多篇高質量應用文獻發(fā)表[13,14,15]。

實現(xiàn)氫氘交換質譜技術的第四個關鍵點，是如何高效分析實驗產生的多時間點及多次重復帶來的大量數(shù)據。人工完成如此巨大的信息處理工作，將消耗科學家大量的時間。沃特世氫氘交換質譜解決方案所提供的DynamX軟件可以為科學家提供簡便直觀的分析結果，并包含多種呈現(xiàn)方式。

 

在某些特殊研究中，要求對蛋白氫氘交換位點做到精確到氨基酸的測量，這是氫氘交換質譜研究的又一個難點。在常規(guī)的研究中采用CID（碰撞誘導解離）碎裂模式，可能導致氘原子在多肽內重排，而致使不能對發(fā)生交換的具體氨基酸進行精確定位。SYNPAT質譜提供的ETD（電子轉移解離）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混亂，并具有良好的碎裂信號[16]。

沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System為氫氘交換質譜實驗提供了前所未有的簡易的解決方案，強有力地推動了氫氘交換技術在蛋白質結構及動態(tài)變化研究、蛋白質相互作用位點發(fā)現(xiàn)、蛋白表位以及活性位點鑒定方面的應用，正在成為眾多結構生物學科學家和生物制藥企業(yè)必不可少的工作平臺。