蛋白質(zhì)糖基化是生命系統(tǒng)非常重要的翻譯后修飾之一，在免疫識別，蛋白分泌，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程中發(fā)揮了重要作用。與蛋白相連的多聚糖是這些功能的重要載體，特別是對于單克隆抗體藥物，多聚糖部分對藥物的生物活性有著重要的影響。因此，發(fā)展分離效率高，檢測靈敏度好的糖基化分析方法對單克隆抗體藥物分析具有十分重要的意義。

 

針對糖基化分析中的種種困難，沃特世公司開發(fā)了親水作用色譜法，以及熒光-質(zhì)譜結(jié)合檢測的分析方法。ACQUITY UPLC系統(tǒng)配合熒光檢測器?(FLR)以及多聚糖分析專用(GST )色譜柱，比HPLC方法有更高的分離度。多聚糖分析專用色譜柱裝填了1.7μm的酰胺吸附劑，可在HILIC模式下有效分離熒光標記的多聚糖。UPLC配合熒光檢測器®分析多聚糖可以獲得很高的分離度和定量準確性，特別是對于位置異構(gòu)體以及有共流出的小峰分析；而質(zhì)譜檢測為糖鏈鑒定提供了更多的結(jié)構(gòu)信息。通過與標準糖鏈保留時間的比較，該流程能實現(xiàn)高通量的多聚糖定性定量，滿足藥物分析的多種需求。
 

一、色譜條件與標記后的多聚糖樣品的分離

可通過HILIC方法，有效分離2-AB標記的多聚糖混合物。對于方法優(yōu)化，使用更緩的窄梯度，可有效提高保留時間上相臨近的多聚糖峰之間的分離度；對于其它的參數(shù)，如流速、緩沖液濃度、流動相pH及柱溫等，一般也需要進行優(yōu)化。圖1示例使用優(yōu)化后的HILIC色譜條件后，復(fù)雜的2-AB標記的IgG多聚糖混合物得到了很好的分離，包括E1/ E2與F1/ F2。實驗所用梯度洗脫時間為45分鐘，包括色譜柱清洗和再平衡步驟。一般來說，一個樣品的總分析時間在1小時內(nèi)。因此，與使用3.0-μm填料的HPLC方法相比，使用1.7-μm填料的UPLC色譜方法，不但分離效果更好，而且運行時間更短。實驗中使用2.1 x150 mm色譜柱。圖1(B)中甘露糖5(峰C)與甘露糖6(峰H)可與鄰近多聚糖峰成功分離，解決了共流出的問題。

二、2-AB標記的多聚糖定量及結(jié)構(gòu)鑒定

由于多聚糖在HILIC 模式下能實現(xiàn)基線分離，各種異構(gòu)體，例如末端唾液酸的位置異構(gòu)，都能得到很好的分離。因此，在熒光檢測器下的峰面積積分能對各種糖鏈進行定量分析。而從MS譜圖來看，多聚糖樣品中高甘露糖糖型所占比例較高，而復(fù)合型及雜合型糖鏈也都能夠得到鑒定。各種帶有神經(jīng)氨酸的糖鏈也都能得到鑒定，表明該方法能夠適合各種多聚糖復(fù)合物的分析。除了分子量，我們還能通過MS/MS譜圖進一步確認多聚糖的結(jié)構(gòu)。

 

2-AB標記的IgG多聚糖混合物的分析結(jié)果充分說明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案，且相應(yīng)色譜柱的質(zhì)量控制采用了2-AB標記的IgG多聚糖混合物進行。ACQUITYUPLC系統(tǒng)顯著縮短了分析時間，將常規(guī)HPLC上需要2個小時甚至3個小時的分離梯度縮短到1小時。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MS的整體解決方案可以十分有效的對多聚糖進行分析，除提供分子量信息外，還可以進行糖結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，大大降低了生物藥物研發(fā)工作中糖基化分析的難度。
 

一、2-AB 標記糖鏈

使用GlycoPro  le試劑盒，Prozyme公司

使用試劑盒進行2-AB 標記糖鏈時，除以下步驟，按照該公司的說明操作即可。

1.使用50μl的標記反應(yīng)液

2. 65度反應(yīng)4-5小時

3.將樣品按步驟4處理除掉過量的標記試劑

 

使用Sigma公司試劑

1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液（ 3 0 μ l 冰醋酸，700ulDMSO）

2.按照20：1（v/w）的比例配制2-AB 溶液 （如需要20mg 2-AB，則用400μl 30% 的醋酸DMSO溶液配制）

3.以16.7：1（v/w）的比例將2-AB溶液與氰基硼氫化鈉混合配制標記反應(yīng)液

4.將所得糖鏈用50μl標記反應(yīng)液溶解，65度震蕩反映4-5小時

5 .將反應(yīng)液按步驟4處理除去過量的標記試劑
 

二、使用MassPrep親水作用樣品處理板除去過量的標記試劑

所需溶液: MiniQ 純水，90% 乙腈 ACN，10 mM 醋酸銨Tris，20% ACN

1.樣品處理板活化，向樣品處理板加入200μl MiniQ純水，再加入 200μl 90% ACN，重復(fù) 90% ACN

2.吸取 50μl 標記溶液，加入 450μl ACN（ 如有沉淀，請勿離心，以免降低糖鏈回收率），由于板上每孔體積為200μl，可以將樣品分為四份加入

3.將樣品加入處理板，設(shè)定真空度為低（壓力 250-500 mmHg），以保證樣品與HILIC基質(zhì)有充分時間相互作用；如果溶液在板上沒有移動，可適當(dāng)增加真空度

4.用 90% ACN清洗處理板兩次

5.換用樣品收集板，用200μl 10 mM 醋酸銨Tris， 20%ACN洗脫，洗脫液轉(zhuǎn)移至1ml 離心管

6.冷凍干燥標記后糖鏈溶液凍干后的樣品復(fù)溶于20μl50% ACN中，超聲5 min 后轉(zhuǎn)入UPLC采樣瓶，進樣5μl。

 

參考文獻

(1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column

(2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine

(3) Joomi Ahn，Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC親水相互作用色譜(HILIC)-熒光檢測法分析2-AB標記的多聚糖