一、驗(yàn)證方案的起草與批準(zhǔn)

    1.驗(yàn)證方案起草

      起草人：       起草時(shí)期：

    2.驗(yàn)證小組成員：

    3.驗(yàn)證方案審核

    4.驗(yàn)證方案批準(zhǔn)

      批準(zhǔn)人：       批準(zhǔn)日期：

二、驗(yàn)證方案

    1.驗(yàn)證目的和原理

    1.1驗(yàn)證目的

       為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的測(cè)定，特制定本方案。驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需要變更時(shí)，應(yīng)報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2原理

       通過比較試驗(yàn)4組中試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長結(jié)果來評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。

    2.驗(yàn)證方法步驟

    2.1驗(yàn)證前的準(zhǔn)備：進(jìn)行微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗(yàn)證前，所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格

       按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果沒有影響。試驗(yàn)菌應(yīng)包括G—、G+、酵母菌和霉菌類微生物以基本覆蓋樣品中可能存在的微生物。

    2.2驗(yàn)證試驗(yàn)的操作計(jì)劃：用3個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)品微生物限度檢測(cè)方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，通過計(jì)算回收率來判斷限度檢查方法是否對(duì)產(chǎn)品有影響。

    2.3試驗(yàn)結(jié)果可接受標(biāo)準(zhǔn)：用標(biāo)準(zhǔn)菌株評(píng)價(jià)方法“ ”的微生物限度檢查對(duì)檢品中微生物的抑制性，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)顯示3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)不小于70%，試驗(yàn)組回收率也不低于70%。

    3.試驗(yàn)實(shí)施

    3.1試驗(yàn)前的準(zhǔn)備

    3.1.1主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺(tái)。

    3.1.2操作環(huán)境：操作間應(yīng)該安裝空氣除菌過濾層裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)該保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于4.9pa。

    3.1.3試驗(yàn)樣品： 

         批號(hào)：    批號(hào)：      批號(hào)： 

    3.1.4培養(yǎng)基：

    3.1.5稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液

         以上經(jīng)115℃高壓蒸汽滅菌30min。

    3.1.6驗(yàn)證用微生物名稱及其編號(hào)

         實(shí)驗(yàn)菌株的來源： 

         編號(hào)由菌名首字母—傳代代數(shù)—制備日期組成。

    3.1.7器具：無菌薄膜過濾器：（孔徑0.45um直徑50mm）、無菌移液管（5ml）

    4.驗(yàn)證方法

    4.1菌液的制備

       將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至10ml的無菌營養(yǎng)肉湯中在30～35℃下培養(yǎng)18～24小時(shí)，將白色念珠菌接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在23～28℃下培養(yǎng)24～48小時(shí)。將黑曲霉接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中，在23～28℃下培養(yǎng)5～7天。將上述培養(yǎng)物用0.9%的無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌落數(shù)為50～100cfu的菌懸液。

    4.2實(shí)驗(yàn)方法

       供試液的制備：取樣品10g（ml）加入無菌PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖使分散均勻，用勻漿儀混勻，置45℃水浴使膠囊殼溶化混勻，制成1：10均勻的供試液。

       A.樣品試驗(yàn)組

       取1:10供試液（相當(dāng)1g或1ml供試品）10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，在*后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

       B.菌液組

       取上述制備菌液各1ml加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上（接觸細(xì)菌和樣品的面）貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

       C.供試品對(duì)照組

       取上述1：10供試液10ml，加至100ml稀釋液中混勻，過濾并用稀釋液沖洗濾膜3次，每次100ml，濾完后，將濾膜取出，接觸樣品的面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

       D.稀釋劑對(duì)照組

       取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入50~100cfu菌液，濾完后，將接有細(xì)菌的濾膜取出，菌面向上貼于已凝固的培養(yǎng)基上。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上；白色念珠菌、黑曲霉貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平皿上。

    4.3培養(yǎng) 

       將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在30～35℃下培養(yǎng)48小時(shí)，將白色念珠菌、黑曲霉在23～28℃下培養(yǎng)72小時(shí)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。

    5.試驗(yàn)結(jié)果

    5.1產(chǎn)品試驗(yàn)組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 

    5.2供試品對(duì)照組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 

    5.3稀釋劑對(duì)照組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 

    5.4菌液組微生物生長檢查情況： 批號(hào)： 

    6.回收率計(jì)算

    6.1稀釋劑對(duì)照組菌回收率

       表中：回收率=稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

    6.2試驗(yàn)組菌回收率

       表中：回收率=（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)）÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

    7.結(jié)論：

    7.1經(jīng)過驗(yàn)證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為 %、 %、 %、 %、 %。

    7.2稀釋劑回收率為 %、 %、 %、 %、 %。 

       以上驗(yàn)證結(jié)果證明，本品 采用上述方法進(jìn)行微生物限度檢查。

       檢驗(yàn)人：          復(fù)核人：

    8.驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)分析

      質(zhì)控部負(fù)責(zé)各項(xiàng)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果記錄，驗(yàn)證小組根據(jù)驗(yàn)證、試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，起草驗(yàn)證報(bào)告，報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)。

      驗(yàn)證委員會(huì)負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)審，做出驗(yàn)證結(jié)論，發(fā)放驗(yàn)證證書。對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的評(píng)審應(yīng)包括：

     （1） 驗(yàn)證試驗(yàn)是否有遺漏；

     （2） 驗(yàn)證實(shí)施過程中對(duì)驗(yàn)證方案有沒有修改，修改原因、依據(jù)以及是否經(jīng)過批準(zhǔn)；

     （3） 驗(yàn)證記錄是否完整；

     （4） 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，偏差及對(duì)偏差的說明是否合理，是否需進(jìn)一步補(bǔ)充試驗(yàn)。

    9.終審批

      驗(yàn)證報(bào)告由驗(yàn)證組長審核后，報(bào)驗(yàn)證總負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，并簽發(fā)驗(yàn)證證書。

   
驗(yàn)證報(bào)告

      年 月 日至 年 月 日，驗(yàn)證小組根據(jù)批準(zhǔn)的微生物限度檢查方法（薄膜過濾法）驗(yàn)證文件對(duì)微生物限度檢查法進(jìn)行了相關(guān)的一系列驗(yàn)證工作，達(dá)到了預(yù)期效果，滋將有關(guān)事項(xiàng)說明如下：

    1、 驗(yàn)證方案在實(shí)施過程中未做修改。

    2、 驗(yàn)證方案各項(xiàng)性能指標(biāo)在驗(yàn)證中未作變動(dòng)，誤差在允許范圍內(nèi)。

    3、 驗(yàn)證過程中結(jié)果符合規(guī)定要求，記錄完整屬實(shí)。

    4、 驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)計(jì)要求和GMP原則要求，可以投入使用。

    5、 組分或檢驗(yàn)條件改變時(shí)須重新驗(yàn)證。

    以上情況，請(qǐng)驗(yàn)證委員會(huì)審批！

    驗(yàn)證小組：        年 月 日