答：可以從這幾個方面一一考慮：

 

（1）設計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質。對于前一種情況應該重新設計抗原，設計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認小分子物質是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。

 

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關動物免疫的部份，實際操作中的相關程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

 

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嘗試。

 

（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

 

（5）免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內(nèi)免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

 

（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

 

2.  為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？

 

答：可以從這幾個方面考慮：

 

（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。

 

（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

 

（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。

 

（4）未正確制備飼養(yǎng)層細胞。參見本站有關飼養(yǎng)層細胞制備的部份。

 

（5）接種雜交瘤細胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

 

（6）融合后，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。

 

（7）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

 

（8）細胞培養(yǎng)條件不正確，確保細胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

 

（9）其它與融合條件相關的不恰當?shù)囊蛩�。詳見本站有關細胞融合的部份。

 

3.  為什么融合后得不到陽性克��？

 

答：可能的原因：

 

（1）動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。

 

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁面第2個問題。

 

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當?shù)亩�抗等諸多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

 

（4）抗原成份與細胞培養(yǎng)條件中的物質相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結構相同或類似的物質產(chǎn)生了競爭反應。舉個簡單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

 

（5）其它所有能影響ELISA等相關篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關ELISA實驗的講解與討論。

 

4.  為什么我的細胞生長很慢？

 

答：可能的原因：

 

（1）使用了劣質的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養(yǎng)實驗，根據(jù)骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質量。

 

（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

 

（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。

 

（4）其它問題，可以參考本頁面第二個問題。

 

5.  我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉為陰性了？

 

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復蘇操作時，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮�。但是也有一些辦法盡量減少陽性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個方面加以注意：

 

（1）永遠保證細胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換，一般來說，當細胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養(yǎng)基了，除了換培養(yǎng)基，同時應該控制好細胞的密度，可以吹走過多的細胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。

 

（2）對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。

 

（3）不要過于頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。

 

（4）對于傳代次數(shù)較多的細胞株需要經(jīng)常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

 

（5）當細胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉為陰性的情況。

 

6.  為什么我做亞克隆后長不出克隆來？

 

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

 

（1）亞克隆時，原始孔里的細胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆。

 

（2)亞克隆時，沒有按照正確的數(shù)量取出細胞，在本站有關亞克隆操作的頁面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結果。

 

（3）未添加飼養(yǎng)層細胞。單個細胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。

 

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態(tài)。

 

（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個細胞是很難長成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無血清培養(yǎng)基。

 

7.  為什么我凍存的細胞很難復蘇或者復蘇不活？ 

 

答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：

 

（1）凍存液的配方。這個問題很關鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的完全培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

 

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復蘇成活的機會就明顯會下降。

 

（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是最理想的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，最后轉入-80 ℃放置過夜，最終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行�，F(xiàn)在市場上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉至液氮中即可。

 

（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，最終可能造成細胞污染。

 

（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。 

 

對于復蘇過程，需要注意：

 

（1）快速。為了防止升溫中細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復蘇，并不斷晃動凍存管。

 

（2）復蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復蘇的細胞被污染。

 

（3）有的人復蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對細胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。

 

8.  為什么我的細胞總是污染？如何可以救活污染的細胞？

 

答：養(yǎng)細胞出現(xiàn)污染，幾乎是每個細胞培養(yǎng)技術員容易出現(xiàn)的問題。要防止細胞污染，無非就是保證培養(yǎng)環(huán)境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時提高操作時的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話了。下面講一講如何挽救一株已經(jīng)被污染的細胞株。 

 

（1）體外用抗生素消滅。一般來說，一旦發(fā)現(xiàn)細胞被微生物污染，應該馬上進行處理，也許還有一線挽救的機會。 但是這種挽救不是盲目的，首先應該決斷是哪一類生物造成的污染。細胞的污染大致可以分三類：細菌污染、真菌污染和支原體污染。 在顯微鏡下仔細觀察，這三種微生物污染區(qū)別還是比較明顯的：如果有大量運動的微生物，且形態(tài)較大，輪廓清晰可見，呈較大幅度運動，并且培養(yǎng)基在短時間內(nèi)變酸，則很可能是細菌污染；如果在顯微鏡下觀察有典型的斑狀或絲狀微生物（注意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區(qū)別開），基本上看不到明顯的運動，則很可能是真菌污染；如果看不到明顯的微生物，并且培養(yǎng)基沒有明顯的顏色上的變化，而細胞狀態(tài)很差，細胞邊緣極其不光滑，而且細胞又莫名其妙地死亡或生長極其緩慢，則有可能為支原體污染，但不能下明確的結論，如果非常需要知道是否為支原體污染可以使用相關的試劑盒進行檢測。 對于細菌或真菌的污染，可以先把細胞收集起來，用干凈的培養(yǎng)基洗滌離心，交替進行幾次，再把洗干凈的細胞放在新的培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi)，加高濃度的抗生素培養(yǎng)，同時強烈建議加入小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)層，以輔助消除微生物。對于細菌污染，可以把青霉素的濃度提高至10倍左右，鏈霉素濃度提高至5-10 倍，也可以用10倍濃度的卡那霉素替代鏈霉素。 對于真菌污染，可以在培養(yǎng)基中加入約5 ug/ml的咪康唑（注射用達克寧）抑制。 對于這兩種情況的污染，采用上述方法處理后，待細胞稍有好轉，并且沒有發(fā)現(xiàn)更大規(guī)模的污染時，需要盡快重復上面的處理步驟。需要注意的是，此時細胞生長受抗生素的影響比較大故而生長很慢。如果多次傳代均未發(fā)現(xiàn)污染復發(fā)，可以慢慢降低抗生素濃度直至常規(guī)濃度，確定是否完全根除污染。最好進行一次有限稀釋的亞克隆操作，以獲得更加純凈的細胞株。 而對于支原體污染，則比較麻煩，一般的抗生素是很難解決的，對于輕度的污染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素和10 ug/ml左右的環(huán)丙沙星交替處理。如果得到明顯的緩解，建議馬上做亞克隆操作，看看是否得到污染根除的細胞株，如果此方法無效，則不能單純利用抗生素來解決污染問題。 

 

（2）體內(nèi)法。這個辦法很簡單，原理就是動物體有強大的免疫系統(tǒng)，一般的微生物都可以被動物體消滅。具體操作和制備腹水的方法完全一樣，即先用IFA或石蠟制敏小鼠，數(shù)天后腹腔注射污染的雜交瘤。如果情況緊急，致敏當天注射雜交瘤也行。一般十天后小鼠產(chǎn)生腹水，在超凈臺無菌采出腹水，其中即含有大量的雜交瘤細胞，一般是可以除掉污染的微生物的。也可以在小鼠背部注射雜交瘤，十幾天后可以看到實體瘤形成，也可以在超凈臺上無菌采摘，然后放回培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶等容器內(nèi)培養(yǎng)。如果被污染的細胞很少，比如說在96孔板上就被污染了，這時候不能進行腹腔注射，也不要進行皮下注射，否則細胞很容易被老鼠的免疫系統(tǒng)攻擊而死亡的，最好的辦法是采用脾內(nèi)注射的方法進行，同時在腹腔內(nèi)用IFA或石蠟油致敏，十幾天后，同樣可以形成腹水，其中即含有干凈的雜交瘤細胞。 如果擔心小鼠會受到微生物感染，可以在培養(yǎng)基中先加入高濃度的抗生素，然后連同抗生素一起注射到小鼠體內(nèi)。 

 

如果確定細胞污染極其嚴重，并且細胞已大面積死亡，建議放棄，迅速做好環(huán)境清潔工作，對細胞操作間作徹底消毒，重新做融合而獲得新的細胞株，不可因小失大造成其它的細胞也被污染。

 

9.  為什么我的雜交瘤細胞不能制備腹水或者制備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價？

 

答： 不能制備腹水的原因大部份是人為的原因：

 

（1）致敏不正確，例如使用了不正確的致敏劑，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。

 

（2）雜交瘤的接種位置不正確，沒有打到腹腔，而是打到了皮下。

 

（3）接種的雜交瘤細胞數(shù)量太少或者細胞狀態(tài)不好。一般不應少于10萬個細胞，建議在100萬個細胞左右為宜。

 

（4）制備腹水小鼠的種系與參與融合的細胞來源的動物種系相差太遠，以至制備腹水的小鼠對雜交瘤有強大的免疫反應將其殺死，建議更換小鼠品系重新接種。 

 

對于腹水沒有效價，可能的原因：

 

（1）制備腹水的雜交瘤極不穩(wěn)定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內(nèi)就失去了分泌能力。

 

（2）致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑，如使用了弗氏完全佐劑，這時即使不打雜交瘤，小鼠也會產(chǎn)生腹水。

 

（3)極其罕見的情況，就是此雜交瘤生產(chǎn)的抗體可以與小鼠體內(nèi)的分子相互作用，于是雜交瘤產(chǎn)生的抗體被小鼠的相關蛋白中和，這種情況下，小鼠的身體可能會出現(xiàn)明顯的異常。

 

（4）檢測腹水效價的實驗方案有問題，或者腹水稀釋比過大。 

10.  免疫失敗的可能原因及應采取的措施

答：有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。

（1）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數(shù)量。

（2） 抗原質量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

（3） 制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方面去考慮，并加以改進。

（4） 所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

（5） 免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

（6） 動物的飼養(yǎng)是否得當，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

11.  制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

答：由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

（1）污染： 包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。

（2）融合后雜交瘤不生長， 在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

PEG有毒性或作用時間過長。

牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。

骨髓瘤細胞污染了支原體。

HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

 

（3）雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮裕�可能是細胞支原體污染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而 抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

要應用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。

要定期進行再克隆。

三不要：

不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

 

（4）雜交瘤細胞難以克隆化

可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養(yǎng)液加HT。