目前，無(wú)血清培養(yǎng)基的研究有兩個(gè)方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動(dòng)物來(lái)源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無(wú)血清培養(yǎng)基歸納為以下四種：

 

（1)無(wú)血清培養(yǎng)基，為一般意義上無(wú)血清培養(yǎng)基，用各類可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白(BSA) 、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高,添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動(dòng)物來(lái)源蛋白。

 

(2)無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基，許多商業(yè)公司開發(fā)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無(wú)動(dòng)物來(lái)源，需要的蛋白來(lái)源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的需要。

 

(3)無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基完全不用動(dòng)物來(lái)源的蛋白，但仍有部分添加物是來(lái)源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對(duì)穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的。

 

(4)化學(xué)組分限定培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加的少量動(dòng)物來(lái)源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究，同時(shí)分離純化也比較方便。

 

無(wú)血清培養(yǎng)基種類：

 

一、CHO：

 

      CHO細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國(guó)科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉(cāng)鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達(dá)。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無(wú)脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?γ-半醛，培養(yǎng)過(guò)程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長(zhǎng)。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長(zhǎng)。

 

      目前已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑（tPA）、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg）、干擾素γ（IFNγ）、干擾素β（IFNβ）、白細(xì)胞介素2（IL2）、凝血因子Ⅷ等在CHO細(xì)胞中得到表達(dá)。在美國(guó)已注冊(cè)的大約73 種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的有35 種，CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的就占27 種，其中包括10種單克隆抗體。

 

二、BHK：

 

      BHK21細(xì)胞是幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney ）。1961 年3 月，I.A.Macpherson 和 M.G.P. Stoker 從一日齡敘利亞地鼠腎分離建株，經(jīng)過(guò)84 天連續(xù)培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞，即clone 13 或C13。BHK21 細(xì)胞廣泛用于增殖各種病毒，已成為制備口蹄疫疫苗所需病毒抗原的理想細(xì)胞培養(yǎng)系，應(yīng)用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)，之外還可用于生產(chǎn)狂犬疫苗等其它獸用疫苗。BHK21 細(xì)胞染色體分布頻率是n＝44，為異雙倍體細(xì)胞系，4倍體發(fā)生率為4％，大多數(shù)細(xì)胞核型分析為44，XY，-6，-15，6q+，15q+。原始的BHK21 細(xì)胞株為成纖維細(xì)胞，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，后經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng)。美國(guó)ATCC保存BHK21細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-10，為C13 克隆株。對(duì)于BHK21細(xì)胞， ATCC 推薦使用的培養(yǎng)方式為：使用含10％胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37.0°C，細(xì)胞培養(yǎng)后使用0.25％胰酶和0.03％EDTA消化細(xì)胞，細(xì)胞分種比例為1：2－1：10，每周1－2 次細(xì)胞傳代。主要用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)。

 

三、Vero：

 

Vero細(xì)胞是成年非洲綠猴腎細(xì)胞（Adult African Green Monkey Kidney ）。上皮細(xì)胞，貼壁依賴性生長(zhǎng)。該細(xì)胞是日本千葉大學(xué)的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日從一只正常的成年非洲綠猴腎組織培養(yǎng)出來(lái)的。其可增值多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)疫苗，被批準(zhǔn)用于人體。也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測(cè)。在非典期間又為研究冠狀病毒做出貢獻(xiàn)，在醫(yī)藥研究中廣泛應(yīng)用。美國(guó)ATCC保存Vero細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-81。對(duì)于Vero細(xì)胞， ATCC推薦使用的培養(yǎng)方式為：使用含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37.0°C，細(xì)胞培養(yǎng)后使用用 0.25% (w/v) 的胰酶和0.53 mM EDTA消化細(xì)胞，推薦的細(xì)胞分種比例為1：4，傳代期間，每周更換培養(yǎng)液2～3次。

 

      Vero細(xì)胞可使用方瓶或轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)于生物制藥企業(yè)，多使用15L轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)制備Vero細(xì)胞的主要問(wèn)題在于如何避免污染，以及細(xì)胞良好生長(zhǎng)與傳代。與原代細(xì)胞以及二倍體細(xì)胞比較，Vero細(xì)胞更容易控制與培養(yǎng)，由于Vero細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，可進(jìn)行大比例分種培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)效果的因素較多，比如細(xì)胞消化液的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)操作程序的使用，但作為重要的生物制藥原材料，細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)效果的重要性得尤為突出。細(xì)胞培養(yǎng)基不僅為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必要的各種營(yíng)養(yǎng)成分，還為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境，而且，在利用細(xì)胞進(jìn)行生物制藥時(shí)，培養(yǎng)基的成分可直接影響制藥產(chǎn)品的質(zhì)量。Vero細(xì)胞可使用多種細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使用的血清含量通常為10%。Vero 細(xì)胞經(jīng)較低濃度的血清適應(yīng)傳代后，可適應(yīng)低血清濃度而良好的生長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯影響。

 

四、MDCK

 

      MDCK細(xì)胞系(MDCK Cell Lines)由Madin和Darby于1958年從美國(guó)Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育建立，通常是以貼壁方式生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞。犬腎上皮連續(xù)細(xì)胞系MDCK (Madin-Daby canine kidney cells) 廣泛用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，如：呼腸孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)、貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒(Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV)及禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細(xì)胞系(MDCK Cell Lines)被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一。傳統(tǒng)的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式。血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物，其含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素 以及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以有效地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)。然而，血清的應(yīng)用也存在許多問(wèn)題：易受病毒、支原體或其他病原體的污染；批間差異造成產(chǎn)品批 次間的質(zhì)量難以嚴(yán)格控制；大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，部分蛋白難以通過(guò)分離純化手段徹底去除，影響了產(chǎn)品的最終質(zhì)量；此外，血清 來(lái)源困難、價(jià)格昂貴，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用血清將會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。