通常第一維電泳是等電聚焦,在細管中（φ1～3 mm）中加入含有兩性電解質、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦,變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離.而后將凝膠從管中取出,用含有SDS的緩沖液處理30 min,使SDS與蛋白質充分結合.

    將處理過的凝膠條放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接.在第二維電泳過程中,結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS－聚丙烯酰胺凝膠,在濃縮膠中被濃縮,在分離膠中依據其分子量大小被分離.

    這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上.細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質,有些報道可以分辨出5000～10000個斑點,這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近.由于二維電泳具有很高的分辨率,它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白.