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志賀氏菌是引起人類(lèi)急性感染性痢疾最為常見(jiàn)的食源性病原菌，俗稱(chēng)痢疾桿菌，為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，無(wú)動(dòng)力，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛、有菌毛，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。根據(jù)其抗原構(gòu)造的不同，可分為A、B、C、D四個(gè)亞群，分別是痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋氏志賀氏菌。
志賀氏菌具有高度傳染性，易引起的細(xì)菌性痢疾，主要通過(guò)消化道途徑傳播，這與衛(wèi)生條件差，食物和水污染以及擁擠的生活條件有關(guān)。據(jù)調(diào)查，全球每年約有1.6億人患病，大約有110萬(wàn)人死亡，其中絕大多數(shù)是兒童。在中國(guó)最為常見(jiàn)的是由福氏和宋內(nèi)志賀菌引起的菌痢，在內(nèi)陸地區(qū)分布廣泛，是各地衛(wèi)生部門(mén)重點(diǎn)檢測(cè)的對(duì)象。
目前，針對(duì)志賀氏菌的特點(diǎn)和危害，國(guó)家衛(wèi)生部已將志賀氏菌列入了肉、蛋、水產(chǎn)、飲料、調(diào)味品、糖果及酒類(lèi)等食品的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，并制定了與之相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)——《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》(GB4789.5-2012)。今天，我們就共同來(lái)了解下食品中志賀氏菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)吧。
適用于食品中志賀氏菌的檢驗(yàn)。
主要儀器
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分液器
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拍擊式均質(zhì)器
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定量接種環(huán)
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厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)
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生化鑒定系統(tǒng)
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志賀氏菌增菌肉湯
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麥康凱（MAC）瓊脂
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木糖賴(lài)氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂
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三糖鐵（TSI）瓊脂
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半固體瓊脂
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營(yíng)養(yǎng)瓊脂
志賀氏菌檢驗(yàn)流程
4.1 樣品制備、增菌
以無(wú)菌操作取檢樣 25 g（mL），加入裝有滅菌 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均 質(zhì)器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均質(zhì)；或加入裝有 225 mL 志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì) 器連續(xù)均質(zhì) 1 min～2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于 41.5 ℃±１℃，厭氧培養(yǎng) 16 h～20 h。
4.2 分離
取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板 上，于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 20 h～24 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直徑大 于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h 再進(jìn)行觀察。志賀氏菌在 不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見(jiàn)表 1。
注：若在指定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察， 可繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進(jìn)行觀察。
4.3 初步生化試驗(yàn)
1）分別在MAC瓊脂平板和XLD瓊脂平板上選取2個(gè)以上典型或可疑菌落；2）先用接種環(huán)挑取同一菌落，分別接種到TSI瓊脂斜面、半固體瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，再用接種針在TSI瓊脂斜面和半固體瓊脂斜面上進(jìn)行穿刺；3）標(biāo)記清楚后置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)20～24h，觀察結(jié)果。
觀察TSI瓊脂中斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫，且半固體瓊脂中無(wú)動(dòng)力的菌株，挑取對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型。
4.4 生化試驗(yàn)
用營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上生長(zhǎng)的菌苔，進(jìn)行生化試驗(yàn)，包括β-半乳糖苷酶、尿素、賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗(yàn)。由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗(yàn)，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化特性見(jiàn)表2。
4.5 附加生化實(shí)驗(yàn)
由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型） 菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗(yàn)符合志賀 氏菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)(36 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h)。志 賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D 菌的生化特性區(qū)別見(jiàn)表 3。
由于傳統(tǒng)生化試驗(yàn)過(guò)程需要使用大量試劑，且還需保證有足夠量的菌苔，因此有時(shí)可能需再次對(duì)可疑菌落進(jìn)行擴(kuò)繁。針對(duì)這些問(wèn)題，目前常采用生化試劑盒或生化鑒定系統(tǒng)來(lái)完成這一步驟，以減少操作人員的工作量、降低工作難度，縮短檢測(cè)周期。
4.6 血清學(xué)鑒定（選做項(xiàng)目）
凡疑為志賀氏菌，可挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。
1）抗原準(zhǔn)備：志賀氏菌屬抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。一般采用1.2%～1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。
2）清凝集反：在玻片上選取2塊約1cmx2cm的區(qū)域，用接種環(huán)挑取一環(huán)待測(cè)菌分別放入選定區(qū)域內(nèi)，往其中一塊下部加1滴抗血清，另一區(qū)域下部加1滴生理鹽水（對(duì)照），分別將菌落研成乳狀液，將玻片傾斜搖動(dòng)，使菌與抗體/生理鹽水混合，1min后并對(duì)著黑色背景觀察結(jié)果。
抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒，且生理鹽水中沒(méi)有發(fā)生自凝現(xiàn)象，那么凝集反應(yīng)為陽(yáng)性。
綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。
