無菌驗證分為設(shè)備檢查、煙霧測試和塵埃粒子測試、染色試驗、輔助系統(tǒng)測試、正壓罩環(huán)境預(yù)測試、貼片實驗、瓶內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試、蓋內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試、LG培養(yǎng)基預(yù)測試、產(chǎn)品測試及LG培養(yǎng)基測試十一步。本文會對瓶內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試和蓋內(nèi)、外挑戰(zhàn)測試及LG培養(yǎng)基測試三大部分重點討論。

試驗前準(zhǔn)備工作，需確保包裝物和產(chǎn)品初始菌含量滿足要求：

瓶子(新吹的)：<3CFU/瓶內(nèi)和瓶外；

瓶蓋：<20 CFU / 蓋；

產(chǎn)品：<100 CFU / ml營養(yǎng)菌；

            < 10 CFU / ml耐熱孢子；

工藝水：< 50 CFU / 250 ml。

包裝容器

空瓶：保證平均滅菌率為log6，是指在瓶子的內(nèi)部和瓶蓋消毒接種桿狀菌作為初始帶菌量。整個步驟如下：使用移液槍向130個瓶子接種枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液(載量：每毫升0.1ml/10⁷CFU )并干燥(8到24小時)。注意此處菌體和芽孢數(shù)量會隨時間和溫度損失。

120個瓶子由灌裝機灌注無菌水瓶并由旋蓋機封蓋(以下簡稱“測試樣”)，10個瓶子用于檢測初始帶菌量(以下簡稱“陽性對照樣”) (為了防止菌體數(shù)量過度損失，建議接種濃度要高1個log)。采用端點方法計算-過膜過濾方法確認(rèn)枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行評估。結(jié)果只受目標(biāo)菌影響。

瓶內(nèi)挑戰(zhàn)測試：

①選取260個以上完好空瓶；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁵和10⁶各130瓶，接種位置依瓶型而定，但盡量選擇瓶內(nèi)凹陷不易殺菌的地方，并充分震蕩；

③空瓶正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，以最高生產(chǎn)速度，確保最短時間也能達(dá)到滅菌要求，先低濃度再高濃度，系統(tǒng)需預(yù)先調(diào)試好，無菌罐中準(zhǔn)備好無菌水；

④測試前隨機抽取10⁵的10個空瓶到實驗室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實驗室將空瓶灌裝100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫），蓋上無菌瓶蓋（預(yù)先去除防盜環(huán)并用鋁箔紙包好的經(jīng)121℃*15min濕熱滅菌后的瓶蓋），充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋5個梯度，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實驗計數(shù)，得出空瓶的初始帶菌量；

⑤將120個10⁵空瓶手動放入輸送帶進(jìn)行殺菌、洗瓶、灌裝（灌裝100ml無菌水，根據(jù)瓶型，為維持設(shè)備運轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，可以適當(dāng)提高灌裝量）、封蓋，另120個10⁶空瓶重復(fù)以上操作；

⑥將灌裝好的產(chǎn)品在實驗室充分振蕩后進(jìn)行膜過濾培養(yǎng)48小時后得出空瓶殺菌后殘留帶菌量，注意跟陽性對照實驗室區(qū)分開；

瓶外挑戰(zhàn)測試：

①選取130個以上完好空瓶；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各65瓶，接種位置依瓶型而定，但盡量選擇瓶外凹陷不易殺菌的地方，接種后用記號筆在接種部位做好標(biāo)識；

③空瓶正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，手動掛到輸送帶進(jìn)行測試；

④測試前隨機抽取10⁴的5個空瓶到實驗室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為：到實驗室將空瓶接種位置剪開，放入已滅菌好的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋4個梯度，得出空瓶外部初始帶菌量；

⑤將60個10⁴空瓶經(jīng)過正常的殺菌程序后，灌裝出口放置一次性無菌取樣袋。取出空瓶后，到實驗室將接種標(biāo)識位置剪出，放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，或用已滅菌的棉簽來涂抹接種標(biāo)識位置，將棉簽放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，從而得出瓶外殺菌后殘留帶菌量。另60個10⁵空瓶重復(fù)以上操作；

驗證判定：用陽性對照檢測的含菌量與殺菌后殘留的菌量進(jìn)行對照，從而判定殺菌力（衰減計數(shù)法），帶入以下公式：

Log(Rave ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(∑Sc/Ntest)

∑Rc：陽性對照樣帶菌總數(shù)；

Nsample：陽性對照樣數(shù)量；

∑Sc：測試樣殘留帶菌總數(shù)；

Ntest：測試樣數(shù)量；

Log(Rmin ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(Sc)

Sc：測試樣的殘留帶菌數(shù)最大樣品的菌落數(shù)；

Log(Rmin )：最低殺菌能力

瓶蓋：采用與瓶子相似的方法對瓶蓋(注意瓶蓋應(yīng)外觀良好，此處排除斷環(huán)等情況)接種。我們只對與產(chǎn)品接觸的瓶蓋部分進(jìn)行接種-螺紋線除外。接種60個瓶蓋作為取樣，10個瓶蓋用于檢測初始帶菌量。瓶蓋通過旋蓋機應(yīng)用到灌裝了無菌水的瓶子上。通過端點方法計算-過膜過濾方法確認(rèn)枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行評估。結(jié)果只受目標(biāo)菌影響。

蓋內(nèi)挑戰(zhàn)測試：

①選取130個以上完好瓶蓋；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種瓶蓋：10⁵和10⁶各65個；

③瓶蓋正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，以最高生產(chǎn)速度，確保最短時間也能達(dá)到滅菌要求，先低濃度再高濃度，系統(tǒng)需預(yù)先調(diào)試好，無菌罐中準(zhǔn)備好無菌水；

④測試前隨機抽取10⁵的5個瓶蓋到實驗室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實驗室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中，充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋5個梯度，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實驗計數(shù)，得出蓋內(nèi)的初始帶菌量；

⑤將60個10⁵瓶蓋手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，另60個10⁶瓶蓋重復(fù)以上操作；

⑥將封蓋后的產(chǎn)品（灌裝100ml無菌水，根據(jù)瓶型，為維持設(shè)備運轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，可以適當(dāng)提高灌裝量）在實驗室充分振蕩后，進(jìn)行膜過濾，旋開的瓶蓋也放入濾杯中進(jìn)行沖洗過濾，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實驗計數(shù)，得出蓋內(nèi)的殺菌后殘留帶菌量；

蓋外挑戰(zhàn)測試：

①選取70個以上完好瓶蓋；

②用枯草芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各35個，接種位置盡量選擇蓋外不易殺菌點，接種后用記號筆在接種部位做好標(biāo)識；

③瓶蓋正常風(fēng)干后準(zhǔn)備進(jìn)行測試，手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，另35個10⁵瓶蓋重復(fù)以上操作；

④測試前隨機抽取10⁴的5個瓶蓋到實驗室進(jìn)行陽性對照檢查，其方法為，到實驗室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預(yù)先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中，充分振蕩清洗，然后進(jìn)行梯度稀釋，至少稀釋4個梯度，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進(jìn)行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行，依GB 4789.2-2016菌落總數(shù)混釋法進(jìn)行實驗計數(shù)，得出蓋外的初始帶菌量；

⑤將30個10⁴瓶蓋手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進(jìn)行區(qū)分），進(jìn)行殺菌、沖洗、吹干、封蓋，灌裝出口處用一次性無菌取樣袋取樣。到實驗室將瓶蓋旋開，放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，或用一次性無菌取樣袋直接在封蓋前的下蓋軌道處單個取樣，然后到實驗室將蓋取出，直接放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗后進(jìn)行膜過濾，也可以將無菌水直接倒入無菌取樣袋中，清洗后進(jìn)行膜過濾，從而得出蓋外殺菌后殘留帶菌量。另30個10⁵瓶蓋重復(fù)以上操作；

蓋內(nèi)外的驗證判定方法和瓶內(nèi)外的方法相同。

無菌環(huán)境和無菌介質(zhì)

無菌水：對無菌水制備裝置進(jìn)行微生物檢測，使用PCA和OSA對無菌水進(jìn)行關(guān)于飲料有害菌的微生物檢測，以驗證其無菌性。無菌水用于：瓶蓋浸泡消毒、無菌沖瓶機、瓶口沖洗及外部SIP前后的沖水(噴沖消毒)。另外，熱水殺菌過程被檢測，包括設(shè)定的溫度，壓力和熱滯留時間。121℃作為SIP回管的溫度為前提條件。

無菌水無菌程度的檢驗要在采用正確的殺菌后在無菌水供給的各個端口檢測：如瓶蓋消毒系統(tǒng)，沖瓶機機組，瓶蓋螺旋線的沖洗系統(tǒng)，設(shè)備外部自消毒所用的無菌水（在前面的外部自清洗后進(jìn)行）。

無菌空氣：在使用無菌空氣的機器上（灌裝機，沖瓶機，旋蓋的螺旋線消毒裝置，瞬時殺菌機的緩沖罐）必須對無菌空氣（通過取樣閥）的無菌性進(jìn)行檢測。

預(yù)測試：每次測試最小10,000瓶。灌裝量均為半灌裝。

為了給在瓶子中可能存在的細(xì)菌足夠的生長時間并避免取樣錯誤，一定數(shù)量的經(jīng)過灌裝和封蓋的的樣品要在30℃的溫度下預(yù)保存3天。

無菌驗證

無菌驗證既低酸產(chǎn)品微生物確認(rèn)和驗收測試，可以深入了解工藝流程和灌裝線的微生物狀況。

低酸飲料（PH＞4.5;奶、奶飲料和非碳酸天然礦泉水除外）商業(yè)殺菌率為：

1: 10,000 [pH > 4,5]

在10,000個灌裝的瓶子中，感染擴增飲料有害菌的不多于1瓶。通常認(rèn)證采用linden grain來替代低酸產(chǎn)品。

在驗收生產(chǎn)過程中經(jīng)過在30~35℃溫度下儲存14天后獲得上述殺菌率，即認(rèn)為被證實有效并完成。

產(chǎn)品測試：LG培養(yǎng)基須經(jīng)UHT138℃×32s滅菌或灌裝，驗收生產(chǎn)運行72小時，且在連續(xù)的3天中進(jìn)行。將從生產(chǎn)中逐步提取30,000個瓶子(開機5,000瓶，第24小時后提取5,000瓶，第48小時后提取8,000個，第72小時后提取10,000個，無菌率為每批：1:10,000 或總量：3:30,000)。其中，最后一步的取樣將按如下方式進(jìn)行：生產(chǎn)72小時后，依次打開隔離罩破壞無菌環(huán)境(3分鐘-3扇窗-每扇窗打開1分鐘, 選擇灌裝機和沖瓶機的窗子)。經(jīng)過SOP(時間≤15分鐘)后，開始生產(chǎn)，再取另外2,000瓶)。合計30,000瓶全部半瓶灌裝。待機時每間隔4小時進(jìn)行短時SOP。將這些瓶子至于30~35℃儲存3天之后，在光源下對儲存的瓶子作視覺檢驗，以驗證微生物影響(混濁、菌絲生長)。全檢后將這些瓶子倒置，7天后進(jìn)行再次全檢，如無異常，14天后再進(jìn)行全檢。