一、稱樣:
(1)一般稱量25g,由于稱樣量較大,標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于稱樣的準(zhǔn)確性未作出明確規(guī)定,微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g,一般遵循“宜多不宜少”的原則,即實(shí)際稱樣時(shí)可根據(jù)樣品情況稱取超出25g(如硬質(zhì)糖果等,檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)樣品實(shí)際情況決定如何稱樣);
(2)對(duì)于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的,則須嚴(yán)格精確稱量。
二、樣品稀釋:
(1)固體或半固體:稱取25g樣品于均質(zhì)袋中,加入已滅菌的生理鹽水225g,稍捏碎(特別是糕點(diǎn)/面包及其他淀粉制品),放入拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min,此時(shí)即制備成1:10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中,換上新的滅菌移液器槍頭,緩緩吸取液體后反復(fù)吹打2次,此時(shí)即制備成1:100的勻液,以此類推,制備10倍系列稀釋勻液。
(2)液體樣品:直接吸取原液進(jìn)行檢驗(yàn),稀釋時(shí)可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。
三、稀釋度的選。
液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗(yàn);固體或半固體則必須依據(jù)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn),選取2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)(一般樣品選取1:10,1:100,1:1000三個(gè)稀釋度進(jìn)行檢驗(yàn)。若遇到不常做的樣品,可適當(dāng)延長(zhǎng)稀釋度至1:100000甚至1:1000000)。
四、質(zhì)量控制:
空白對(duì)照:分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對(duì)照。(若空白有菌落生長(zhǎng)則該實(shí)驗(yàn)無(wú)效)。
五、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA):
滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶(三角瓶)中配制400mL/瓶。
六、有時(shí)樣品基質(zhì)比較特殊,樣品勻液有細(xì)小的顆粒與菌落不易區(qū)分,此時(shí)可采用如下方法進(jìn)行區(qū)分:
(1)配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液(又稱紅四唑或紅四氮唑,簡(jiǎn)稱TTC),高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為:121℃、20min;
(2)待PCA瓊脂培養(yǎng)基冷卻至適宜傾注溫度時(shí),無(wú)菌加入上述TTC溶液2mL,充分搖勻(此時(shí)PCA中TTC濃度為0.005%)。
加入TTC的目的及注意事項(xiàng):培養(yǎng)后,菌落被TTC染成紅色,而樣品顆粒不變色,方便計(jì)數(shù);PCA中TTC的濃度不宜過高,否則會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng),對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。(特殊情況下方添加TTC,常規(guī)實(shí)驗(yàn)無(wú)須添加,特別是對(duì)于菌落數(shù)量較少的樣品不宜添加。方法來(lái)源依據(jù)為《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中菌落總數(shù)測(cè)定相關(guān)章節(jié))
七、稀釋液:
常采用0.85%氯化鈉溶液(生理鹽水),121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。
八、傾注培養(yǎng)基時(shí),根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)(同一類型樣品的微生物檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)),若樣品有表面蔓延生長(zhǎng)的可能性,則待第一次傾注的瓊脂凝固后,可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計(jì)數(shù)。
九、水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h;其它樣品36±1℃培養(yǎng)48±2h。注意:此處的“水產(chǎn)品”是指生魚片、魷魚干等未經(jīng)深度加工的水產(chǎn)品。
十、本標(biāo)準(zhǔn)的重難點(diǎn)為菌落計(jì)數(shù)及計(jì)算。
除標(biāo)準(zhǔn)中已說明的要求外,有以下幾點(diǎn)需要注意:
(1)菌落計(jì)數(shù)時(shí),從低稀釋度的平板開始計(jì)數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU,則須計(jì)數(shù)所有平板上的菌落數(shù),但僅采用最接近30CFU的兩個(gè)平板的菌落數(shù)來(lái)計(jì)算最終菌落總數(shù)。
以固體樣品舉例,菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下:
(2)當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋(gè)板上菌落數(shù)高于30,另一個(gè)低于30,則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。(存在爭(zhēng)議,實(shí)際遇到該類情況時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待)
以固體樣品舉例,菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下:
(3)若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU,則只計(jì)數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù),并采用這些數(shù)據(jù),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公式,進(jìn)行最終菌落總數(shù)的計(jì)算,此時(shí)將大于300CFU的記為“多不可計(jì)”,以“TNTC”表示。
以固體樣品舉例,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公示,菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下:
(4)若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都大于300,則不能所有都計(jì)為TNTC,必須將最高稀釋度的兩個(gè)平板上的菌落逐一地計(jì)數(shù),再計(jì)算平均數(shù),該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù),其余平板上的菌落數(shù)可記為TNTC。
以固體樣品舉例,菌落數(shù)選取、計(jì)算過程及結(jié)果修約如下:
(5)計(jì)算菌落總數(shù)時(shí),須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行計(jì)算。
特殊情況:
①若所有平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。“最低稀釋倍數(shù)”并不是固定不變的,與檢驗(yàn)人員選取的稀釋度有關(guān)。如:某樣品多次檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高,檢驗(yàn)人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板,最終所有平板上的均無(wú)菌落生長(zhǎng),則計(jì)算過程為<1×1000,最終結(jié)果為<1000CFU;若選取1:10、1:100、1:1000三個(gè)梯度的稀釋液傾注平板,均無(wú)菌落生長(zhǎng),則最終結(jié)果為<10CFU。因此,稀釋度的選擇對(duì)于結(jié)果存在較大影響,選擇時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。
②最低稀釋度兩個(gè)平板只有一個(gè)平板上長(zhǎng)了1個(gè)菌落,若為固體樣品且本次檢驗(yàn)的最低稀釋倍數(shù)為1:10,此時(shí)計(jì)算過程為(1+0)/2×10=5,由于默認(rèn)固體樣品最小檢出量為10CFU,故本次檢驗(yàn)的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。注意:對(duì)于該情況一直存在爭(zhēng)議,不同的檢驗(yàn)人員可能做法不一,有人保留為5CFU,有人保留為10CFU,并無(wú)固定做法。(建議檢驗(yàn)人員保持一貫做法,不要隨意更改)
舉例如下:
十一、對(duì)于水產(chǎn)品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數(shù)含量較高、限量值較大的食品類別,建議多增加稀釋梯度(可稀釋至10-4甚至10-5),避免稀釋度較低、濃度較大導(dǎo)致培養(yǎng)后平板上菌落蔓延、彌散而難以計(jì)數(shù)甚至無(wú)法計(jì)數(shù)。
GB 4789.10-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)
第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)
1、7.5%氯化鈉肉湯增菌培養(yǎng):
(1)若樣品本身在均質(zhì)后清澈,培養(yǎng)18h觀察呈現(xiàn)一定程度的渾濁(與培養(yǎng)前相比),則接種平板;若18h后仍無(wú)變化,繼續(xù)培養(yǎng)至24h后無(wú)論渾濁與否都接種至平板;
(2)若樣品本身在均質(zhì)后渾濁,則直接培養(yǎng)至24h后再接種平板。
2、血平板:36±1℃培養(yǎng)18h后觀察,若有菌落生長(zhǎng)或有菌落生長(zhǎng)的跡象(無(wú)論是否溶血),則應(yīng)酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中(NA 10mL/管、BHI 5mL/管)、滅菌后NA應(yīng)斜放凝固成瓊脂斜面?zhèn)溆。至血平板培養(yǎng)至24h取出,挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,同時(shí)挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管,36±1℃培養(yǎng)24h。
3、接種原則:
(1)革蘭氏染色后還剩余10個(gè)或10個(gè)以上菌落,則NA、BHI分別接種5管;
(2)若多于5個(gè)(不包括5個(gè))不足10個(gè),則BHI接種5管,剩余的接種NA;
(3)5個(gè)及以下則全部接種BHI,不接種NA。
4、BP平板:36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有菌落生長(zhǎng)則取出,無(wú)菌落生長(zhǎng)則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn),則不必再挑取BP平板上的菌落進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 若血平板上無(wú)菌落生長(zhǎng),則應(yīng)在24h~48h內(nèi)逐步觀察BP平板是否長(zhǎng)菌或有無(wú)長(zhǎng)菌跡象,有則需配置BHI及NA,挑取BP上的菌落進(jìn)行純化、增菌,36±1℃培養(yǎng)24h。
5、血漿凝固酶試驗(yàn):
(1)根據(jù)BHI管數(shù),取凍干血漿粉,每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水,使其充分溶解,再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養(yǎng)物加入其中(每管BHI用1個(gè)槍頭),振蕩搖勻后于36±1℃培養(yǎng),計(jì)時(shí),每30min觀察一次,如呈現(xiàn)凝固(將試管傾斜或倒置時(shí)出現(xiàn)凝塊)或半凝固(一般的液體呈現(xiàn)凝固)則判定為陽(yáng)性。若一直不凝固,則一直觀察,直至觀察至6h(查看12次)還未凝固,則試驗(yàn)終止,判定為陰性結(jié)果;若中途出現(xiàn)完全凝固或半凝固,則試驗(yàn)終止,判定為陽(yáng)性結(jié)果。
(2)同時(shí)取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 6538以及CMCC(B)26003各一支)制成菌懸液后作為陽(yáng)性對(duì)照、以滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照,分別接種至BHI中同步培養(yǎng)后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。
(3)若血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果可疑,則挑取NA上的菌落接種BHI再次進(jìn)行試驗(yàn)。
第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法
1、取1mL樣品稀釋勻液接種3個(gè)BP平板(此處并未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣,由于如此操作會(huì)增加試驗(yàn)時(shí)間,無(wú)法在15min內(nèi)完成試驗(yàn))。
2、涂布時(shí)不要觸及平板邊緣(會(huì)導(dǎo)致樣液涂抹不均勻,大部分匯集于邊緣)。
3、可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進(jìn)行涂布(不用換涂布棒)。
4、涂布完成后應(yīng)稍微放置一段時(shí)間使培養(yǎng)基吸收樣品勻液。
5、若水珠較多,可正置于培養(yǎng)箱中1~2h后再倒置培養(yǎng)。
6、36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有典型菌落生長(zhǎng)則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板)。若無(wú)菌落生長(zhǎng)則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察,有典型菌落生長(zhǎng)則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn),無(wú)典型菌落生長(zhǎng)則試驗(yàn)終止。
第三法 金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)法
1、樣品稀釋同菌落總數(shù),取3個(gè)連續(xù)稀釋度稀釋液(或包括液體樣品原液),每個(gè)稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯,每管接種1mL,36±1℃培養(yǎng)18h后觀察,若出現(xiàn)渾濁則接種至BP平板,若無(wú)變化則繼續(xù)培養(yǎng)至24h后再接種至BP平板。
2、劃線接種至BP平板,36±1℃培養(yǎng)24h后觀察,有典型菌落生長(zhǎng)則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)(革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板)。若無(wú)菌落生長(zhǎng)則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察,有典型菌落生長(zhǎng)則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn),無(wú)典型菌落生長(zhǎng)則試驗(yàn)終止。
3、根據(jù)證實(shí)后的陽(yáng)性管數(shù)差MPN表得出結(jié)果。
GB 4789.4-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)
(標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充)
1、稱取25g樣品于可封口的均質(zhì)袋中,再倒入BPW至250g,盡量排去均質(zhì)袋中的空氣后再封口、均質(zhì)后直接置于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜(標(biāo)準(zhǔn)要求為8~18h,一般培養(yǎng)過夜后第二天早晨繼續(xù)下一步試驗(yàn))
2、TTB、SC應(yīng)酌情配制,現(xiàn)配現(xiàn)用,不宜久置。若BPW放入培養(yǎng)箱的當(dāng)日時(shí)間允許,則可將TTB、SC滅菌、配制、分裝后冷藏以備第二天實(shí)驗(yàn);若當(dāng)日時(shí)間不允許,則次日早晨滅菌、分裝,下午即可轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。
3、TTB:滅菌條件為121℃15min,與一般試驗(yàn)耗材、培養(yǎng)基的滅菌條件一致,故在滅菌時(shí)可考慮同時(shí)滅為一鍋。且須同時(shí)滅一些帶塞(可帶塑料蓋子)的小試管、10mL移液槍槍頭、1mL移液槍槍頭,在滅菌完成后溫度降至不燙手時(shí),輕輕晃動(dòng)三角燒瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混勻,每100mLTTB中加入1支碘液(陸橋,P-72)、1支0.1%煌綠(陸橋,P-73),充分搖勻至整瓶TTB呈現(xiàn)綠色,此時(shí)用移液槍準(zhǔn)確吸取10mLTTB至已滅菌的小試管中,蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中,于42℃培養(yǎng)18~24h(若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無(wú)渾濁,則培養(yǎng)至24h,否則培養(yǎng)至18h即可)。
4、SC:僅需加熱煮沸滅菌(因SC易溶于水,煮沸即可,無(wú)需過度加熱),冷卻至不燙手時(shí)用移液槍吸取10mL分裝至已滅菌的小試管中,蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管SC中,于36±1℃培養(yǎng)18~24h(若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無(wú)渾濁,則培養(yǎng)至24h,否則培養(yǎng)至18h即可)。
5、BS、XLD應(yīng)酌情配制,在用前一天配制后備用(兩者僅需加熱滅菌、不添加任何添加劑,無(wú)需過度加熱)。BS在不燙手時(shí)即可倒成平板,否則容易沉淀或凝固,且在倒平板前應(yīng)充分搖勻以防止有效成分沉淀于底部(棕色或棕黃色顆粒物)。XLD過度加熱會(huì)造成瓊脂不易凝固、劃線時(shí)容易劃破,甚至不凝結(jié)成塊、無(wú)法倒置。
6、XLD培養(yǎng)條件:36±1℃培養(yǎng)18~24h。18h后觀察,若TTB、SC增菌液都有菌落生長(zhǎng),則可挑取任意生長(zhǎng)良好的菌落進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn);若只有其中一種增菌液有菌落生長(zhǎng)、或兩者都無(wú)菌落生長(zhǎng),則繼續(xù)培養(yǎng)至24h再觀察,此時(shí)無(wú)論菌落生長(zhǎng)與否都不再繼續(xù)培養(yǎng),只要其中任一增菌液有典型或可疑沙門氏菌生長(zhǎng)則挑取進(jìn)行生化試驗(yàn)。
7、生化鑒定:
(1)一般情況下,XLD上的任一增菌液長(zhǎng)菌,則BS上對(duì)應(yīng)增菌液也會(huì)長(zhǎng)菌,此時(shí)若已挑取XLD上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn),則無(wú)需挑取BS上的菌落;或XLD上的兩種增菌液長(zhǎng)了形態(tài)特征完全相同的菌落,則挑取任一典型菌落進(jìn)行生化鑒定即可,且無(wú)論BS上菌落生長(zhǎng)如何,都不再挑取BS上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。
(2)若出現(xiàn)XLD未長(zhǎng)菌的增菌液在BS上長(zhǎng)菌,則還需挑取BS上的該菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。
(3)用生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定,依據(jù)產(chǎn)品說明書判斷陰性或陽(yáng)性,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中表2~表5的內(nèi)容逐步進(jìn)行判定(即生化鑒定試劑盒是將標(biāo)準(zhǔn)中的所有鑒定步驟同時(shí)完成,但判定時(shí)依然要按照標(biāo)準(zhǔn)逐步判定,只要其中任一階段可判定為非沙門氏菌屬,則不再往下判定,鑒定試驗(yàn)即終止)
(4)若判定為沙門氏菌屬,則可選擇進(jìn)行或不進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。首先應(yīng)確定該菌落無(wú)自凝性,否則無(wú)法進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。