1 目的
1.1學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)
1.2 建立無菌操作的概念,掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)
2 實(shí)驗(yàn)說明
將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作,如操作不慎引起污染,則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠,影響下一步工作的進(jìn)行。
3 實(shí)驗(yàn)器材
3.1 器械和用品
酒精燈,玻璃鉛筆,火柴,試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。
3.2 菌種和培養(yǎng)基
菌種:大腸桿菌(Escherichia coli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。 培養(yǎng)基:普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。
4 實(shí)驗(yàn)流程
斜面接種法→液體接種法→固體接種法→穿刺接種法。
5 操作步驟
5.1 斜面接種法
斜面接種法主要用于接種純菌,使其增殖后用以鑒定或保存菌種。
通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個菌落,或挑取斜面,肉湯中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進(jìn)行,先點(diǎn)燃酒精燈。
將菌種斜面培養(yǎng)基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間,菌種管在前,接種管在后,斜面向上管口對齊,應(yīng)斜持試管呈45~0度角,并能清楚地看到兩個試管的斜面,注意不要持成水平,以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動兩管棉塞,使其松動,以便接種時易于取出。
右手持接種環(huán)柄,將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分(環(huán)和絲)必須燒紅,以達(dá)到滅菌目的,然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍,尤其是接鎳鉻絲的螺口部分,要徹底灼燒以免滅菌不徹底。用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞,將試管口在火焰上通過,以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無菌棉塞。
將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi),先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上,待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出,接種環(huán)不能通過火焰,應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢,接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口,并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后,放回原處,并塞緊棉塞。將接種管貼好標(biāo)簽或用玻璃鉛筆劃好標(biāo)記后再放入試管架,即可進(jìn)行培養(yǎng)。
5.2 液體接種法
多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng),也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗(yàn),其操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同,僅將不同點(diǎn)介紹如下:
由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基:用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔,接至液體培養(yǎng)基時應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩,或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時,若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時,可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。
由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時,可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可(圖 4-5)。
接種液體培養(yǎng)物時應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上,以免造成污染。如有濺污,可用酒精棉球灼燒滅菌后,再用消毒液擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管,應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。
5.3 固體接種法
普通斜面和平板接種均屬于固體接種,斜面接種法已講了,不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料,進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為:
用菌液接種固體料,包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中,攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內(nèi),否則會使接種后含水量加大,影響培養(yǎng)效果。
用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢子混合種子菌或其他固體培養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可,但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆颉R话闶窍劝逊N子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。
5.4 穿刺接種法
此法多用于半固體、醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種,操作方法與注意事項(xiàng)與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針,而不能使用接種環(huán)。
接種柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時,應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺,一直插到接近管底,再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動,以使穿刺線整齊,便于觀察生長結(jié)果。
6 結(jié)果
分別記錄并描繪平板劃線、斜面和半固體接種的微生物生長情況和培養(yǎng)特征。
7 思考
7.1 如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)?請寫出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。
7.2 為什么高氏I號培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基中要分別加入酚和鏈霉素?如果用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離一種對青霉素具有抗性的細(xì)菌,你認(rèn)為應(yīng)如何做?
7.3 試述如何在接種中,貫徹?zé)o菌操作的原則?
7.4 以斜面上的菌種接種到新的斜面培養(yǎng)基為例說明操作方法和注意事項(xiàng)。
7.5試設(shè)計一個實(shí)驗(yàn),從土壤中分離酵母菌并進(jìn)行計數(shù)。