一、無菌操作要求
食品微生物實(shí)驗(yàn)室工作人員,必須有嚴(yán)格的無菌觀念,許多試驗(yàn)要求在無菌條件下進(jìn)行,主要原因:一是防止試驗(yàn)操作中人為污染樣品,二是保證工作人員安全,防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個(gè)人污染。
1. 接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、戴工作帽。
2. 進(jìn)行接種食品樣品時(shí),必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應(yīng)放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。
3. 接種食品樣品時(shí),應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?/span>
4. 進(jìn)行接種所用的吸管,平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。
5. 從包裝中取出吸管時(shí),吸管尖部不能觸及外露部位,使用吸管接種于試管或平皿時(shí),吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈前操作,接種細(xì)菌或樣品時(shí),吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。
7. 接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲,必要時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處,接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼。
8. 吸管吸取菌液或樣品時(shí),應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取,不得直接用口吸。
二、無菌間使用要求
1. 無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃,并要密封,不得隨意打開,并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門,另設(shè)有0.5-0.7m2的小窗,以備進(jìn)入無菌間后傳遞物品。
2. 無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作臺(tái)面,不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品。
3. 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊,打開紫外燈,如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時(shí),需30W紫外燈,距離在1.0m處,照射時(shí)間不少于30min,使用紫外燈,應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作,以免引起損傷,燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭,除去上面灰塵和油垢,以減少紫外線穿透的影響。
4. 處理和接種食品標(biāo)本時(shí),進(jìn)入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞。
5. 在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時(shí),則應(yīng)有過濾裝置。
三、消毒滅菌要求
微生物檢測(cè)用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經(jīng)滅菌后方能使用。
(一)干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法
1.滅菌前準(zhǔn)備
①所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴(yán)密,如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。
②裝培養(yǎng)基的三角瓶塞,用紙包好,試管蓋好蓋,注射器須將管芯抽出,用紗布包好。
2.裝放
①干熱滅菌器:裝放物品不可過擠,且不能接觸箱的四壁。
②大型高壓蒸氣鍋:放置滅菌物品分別包扎好,直接放入消毒筒內(nèi),物品之間不能過擠。
3.設(shè)備檢查
①檢查門的開關(guān)是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。
②壓力表蒸氣排盡時(shí)是否停留在零位,關(guān)好門和蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。
③對(duì)有自動(dòng)電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序,是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。
4.滅菌處理
①干熱滅菌法:此法適應(yīng)于在干熱情況下,不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。
a. 器械器皿應(yīng)清洗后再干烤,以防附著在表面的污物炭化。
b. 滅菌時(shí)安放物品不能過擠,不要直接接觸底和箱壁,物品之間留有空隙。
c.滅菌時(shí)將箱門關(guān)緊,接上電源,先將排氣孔打開約30min,排除滅菌器中的冷空氣,溫度升至160℃調(diào)節(jié)指示燈,維持1.5 –2h。
d.滅菌完畢后或溫度升溫過程中,須在60℃以下才能打開箱門。
②手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進(jìn)行:
a. 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水,立式高壓鍋加水16L(重復(fù)使用時(shí)應(yīng)將水量補(bǔ)足,水變混濁需更換)。
b. 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中(無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用)。
c. 蓋好頂蓋擰緊,勿使漏氣;置滅菌器于火源上加熱,立式壓力鍋通上電源,并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣(水沸騰后排氣10-15min)。
d. 關(guān)閉排氣閥,使蒸氣壓上升到規(guī)定要求,并維持規(guī)定時(shí)間(按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定)。
e. 達(dá)到規(guī)定時(shí)間后,對(duì)需干燥的物品,立即打開排氣閥排出蒸氣,待壓力恢復(fù)到零時(shí),自然冷卻至60℃后開蓋取物,如為液體物品,不要打開排氣閥,而應(yīng)立即將鍋去除熱源,待自然冷卻,壓力恢復(fù)至零,溫度降到60℃以下再開蓋取物,以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。
③臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進(jìn)行:
a. 關(guān)緊鍋門,打開進(jìn)氣閥,將蒸氣引入夾層進(jìn)行預(yù)熱,夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動(dòng)排出。
b. 夾層達(dá)到預(yù)定溫度后,打開鍋室進(jìn)氣閥,將蒸氣引入鍋室,鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動(dòng)排出。
c. 待鍋室達(dá)到規(guī)定的壓力與溫度時(shí),調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥,使保持恒定至規(guī)定時(shí)間。
d. 自然或人工降溫至60℃再開門取物,不得使用快速排出蒸氣法,以防突然降壓,液體劇烈沸騰或容器爆破。
e.使用自動(dòng)程序控制式壓力蒸氣滅菌器,在放好物品關(guān)緊門后,應(yīng)根據(jù)物品類別按動(dòng)相應(yīng)開關(guān),以便按要求程序自動(dòng)進(jìn)行滅菌,滅菌時(shí)必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時(shí)間以備查,操作要求應(yīng)嚴(yán)格按照廠家說明書進(jìn)行。
5.滅菌溫度與時(shí)間
①干熱滅菌器滅菌溫度160℃,1.5-2h。
②壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時(shí)間見表34-1。
表34-1
物品 |
滅菌時(shí)間,min |
|
115℃ |
121℃ |
|
含糖類等不耐熱培養(yǎng)基
染菌培養(yǎng)物
器械器皿 |
15-20
|
30
30 |
(二)間歇滅菌方法
1.滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌,某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞,可用此法滅菌。
①將欲滅菌物品置于鍋內(nèi),蓋上頂蓋,打開排水口,使器內(nèi)余水排盡。
②關(guān)閉排水口,打開進(jìn)氣門,根據(jù)需要消毒10~20min。
③滅菌完畢關(guān)閉進(jìn)氣門,取出物品待冷至室溫溫度,放入37℃溫箱過夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可達(dá)到滅菌目的。
2.血清凝固器使用方法,培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時(shí),因高熱會(huì)破壞其營養(yǎng)成份,故用低溫,可使血清凝固,又可達(dá)到滅菌目的。
①在使用該法滅菌的血清等分裝時(shí),需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用。
②將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層,加足水后,接上電源,升溫75~90℃1h滅菌,放37℃溫箱過夜,再如此滅菌三次。
3. 煮沸消毒:可用煮鍋或煮沸消毒器,水沸騰后再煮5~15 min,也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min,加入0.02﹪甲醛,80℃煮60 min均可達(dá)到滅菌目的,但選用煮沸消毒的增消劑時(shí),應(yīng)注意對(duì)物品的腐蝕性。
4. 滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查放置,以免再度污染。
①物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用。
②取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。
③培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達(dá)到者應(yīng)廢棄.
④啟閉式容器,在取出時(shí)應(yīng)將篩孔關(guān)閉。
⑤取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。
⑥取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。
⑦凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。
⑧每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時(shí)間、操作者。
四、有毒有菌污物處理要求
微生物實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理,一律不得帶出實(shí)驗(yàn)室。
1. 經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi),并隼中存放在指定地點(diǎn),待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌。
2. 經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物,必須經(jīng)121℃ 30 min高壓滅菌。
3. 染菌后的吸管,使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液體不得低于浸泡的高度)再經(jīng)121℃30 min高壓滅菌。
4. 涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中,經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后,煮沸洗滌。做凝隼試驗(yàn)用的玻片或平皿,必須高壓滅菌后洗滌。
5. 打碎的培養(yǎng)物,立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時(shí)后再擦拭干凈。
污染的工作服或進(jìn)行烈性試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等,應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi),經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。
五、培養(yǎng)基制備要求
培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長(zhǎng)。因?yàn)楦鞣N微生物對(duì)其營養(yǎng)要求不完全相同,培養(yǎng)目的的不同,各種培養(yǎng)基制備要求如下:
1. 根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取,然后溶于蒸餾水中,在使用前對(duì)應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。
2. PH測(cè)定及調(diào)節(jié):PH測(cè)定要在培養(yǎng)基冷至室溫時(shí)進(jìn)行,因在熱或冷的情況下,其PH有一定差異,當(dāng)測(cè)定好時(shí),按計(jì)算量加入堿或酸混勻后,應(yīng)再測(cè)試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準(zhǔn)確,否則會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高,故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多,以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量,指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。
3. 培養(yǎng)基需保持澄清,便于觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,培養(yǎng)基加熱煮沸后,可用脫脂棉花或絨布過濾,以除去沉淀物,必要時(shí)可用雞蛋白澄清處理,所用瓊脂條要預(yù)先洗凈涼干后使用,避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。
4. 盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器,使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。
5. 培養(yǎng)基的滅菌既要達(dá)到完全滅菌目的,又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價(jià)值,一般121℃ 15min即可,如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等,則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌,一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等,待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。
6. 每批培養(yǎng)基制備好后,應(yīng)做無菌生長(zhǎng)試驗(yàn)及所檢菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基,使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng),觀察生化反應(yīng)結(jié)果,應(yīng)呈正常反應(yīng),培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久,必要時(shí)可置4℃冰箱存放。
7. 目前各種干燥培養(yǎng)基較多,每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)或生化反應(yīng)觀察,各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)良好后方可應(yīng)用,新購進(jìn)的或存放過久的干燥培養(yǎng)基,在配制時(shí)也應(yīng)測(cè)PH,使用時(shí)需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行。
8. 每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄,以備查詢。
六、樣品采集及處理要求
1. 所采集的檢驗(yàn)樣品一定要具有代表性,采樣時(shí)應(yīng)首先對(duì)該批食品原料、加工、運(yùn)輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查,檢查是否有污染源存在。
2. 根據(jù)食品的種類及數(shù)量,采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法的要求進(jìn)行。
3. 采樣應(yīng)注意無菌操作,容器必須滅菌,避免環(huán)境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌,更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物,以避免殺死樣品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。
4. 樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn),送檢過程中一般不超過3h,如路程較遠(yuǎn),可保存在1~5℃環(huán)境中,如需冷凍者,則在凍存狀態(tài)下送檢。
5. 檢驗(yàn)室收到樣品后,進(jìn)行登記(樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號(hào)等),觀察樣品的外觀,如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者,可拒絕檢驗(yàn)。
(1) 樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者,失去代表原食品檢驗(yàn)意義者。
(2) 瓶、袋裝食品已啟開者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形狀者(食物中毒樣品除外)。
(3) 按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。
對(duì)送檢符合要求的樣品,檢驗(yàn)室收到后,應(yīng)立即進(jìn)行檢驗(yàn),如果條件不具備,應(yīng)置4℃冰箱存放,及時(shí)準(zhǔn)備創(chuàng)造條件,然后進(jìn)行檢驗(yàn)。
6. 樣品檢驗(yàn)時(shí),根據(jù)其不同性狀,進(jìn)行適當(dāng)處理。
(1) 液體樣品接種時(shí),應(yīng)充分混合均勻,按量吸取進(jìn)行接種。
(2) 固體樣品,用滅菌刀、剪取其不同部位共25g,置于225ml滅菌生理鹽水或其他溶液中,用均質(zhì)器攪碎混勻后,按量吸取接種。
(3) 瓶、袋裝食品應(yīng)用滅菌操作啟開,根據(jù)性狀選擇上述方法處理后接種。
七、樣品檢驗(yàn)、記錄和報(bào)告的要求
1. 檢驗(yàn)室收到樣品后,首先進(jìn)行外觀檢驗(yàn),及時(shí)按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn),檢驗(yàn)過程中要認(rèn)真、負(fù)責(zé)、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作,避免環(huán)境中微生物污染。
2.樣品檢驗(yàn)過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗(yàn)紀(jì)錄,以作為對(duì)結(jié)果分析、判定的依據(jù),記錄要求詳細(xì)、清楚、真實(shí)、客觀、不得涂改和偽造。