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本標準規(guī)定了食品中大腸菌群(Coliforms)計數的方法。
本標準第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數;第二法適用于大腸菌群含量較 高的食品中大腸菌群的計數。
二、術語和定義
1 大腸菌群 Coliforms
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
2 最可能數 Mostprobablenumber
MPN 基于泊松分布的一種間接計數方法。
三、檢驗原理
1、MPN法
MPN 法是統(tǒng)計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養(yǎng)后,根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統(tǒng)計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
2、平板計數法
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產酸,在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。
四、設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下:
.恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃ ±1 ℃
.冰箱:2 ℃~5 ℃
.恒溫水浴箱:46℃±1℃
.天平:感量 0.1g
.均質器
.振蕩器
.無菌吸管:1mL(具 0.01mL 刻度)、10mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭
.無菌錐形瓶:容量500mL
.無菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm
.pH 計或 pH 比色管或精密pH 試紙
.菌落計數器
五、培養(yǎng)基和試劑
.月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉湯
.煌綠乳糖膽鹽(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉湯
.結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violetredbileagar,VRBA)
.無菌磷酸鹽緩沖液
.無菌生理鹽水
.1mol/LNaOH 溶液
第一法：大腸菌群 MPN計數法
一、檢驗程序
二、操作步驟
1、樣品的稀釋
①固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內 ,8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。
②液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶 (瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。
③樣品勻液的pH 應在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl調節(jié)。
④用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖 液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。
⑤根據對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。
2、初發(fā)酵試驗
每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36 ℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發(fā)酵試驗(證實試驗),如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產氣者進行復發(fā)酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
3、復發(fā)酵試驗(證實試驗)
用接種環(huán)從產氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。
4、可能數(MPN)的報告
根據確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索 MPN 表,報告每g(mL)樣品中大腸菌群的 MPN 值。
現(xiàn)行有效的16版&03版
第二法：平板計數法
一、檢驗程序：
1、樣品的稀釋
按MPN法中的稀釋方法進行
2、平板計數
①選取2個~3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1mL。同時取1mL 生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
②及時將15mL~20mL融化并恒溫至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個平 皿中。小心旋轉平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表 層。翻轉平板,置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24h。
3、平板菌落數的選擇
選取菌落數在15CFU~150CFU 之間的平板,分別計數平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落 (如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm 或更大,最低稀釋度平板低于15CFU 的記錄具體菌落數。
4、證實試驗
從 VRBA 平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于 BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣, 即可報告為大腸菌群陽性
5、大腸菌群平板計數的報告
經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每 g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在 VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀 釋倍數計算。
備注:
6.0×105CFU/g(mL)也 就是600000CFU/g(mL)這個作為公司統(tǒng)一的數據修約后的報告方式，若均無菌落生長則報告值為<10CFU/g(mL)
例: 10-2樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有90個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有10個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為: 90×10/10×102/g(mL)=9000CFU/g(mL)
